利用盐酸水解鸡肉小肽工艺条件研究

杨秀娟， 陶琳丽， 邓 斌， 曹志勇， 黄 伟， 陶 冶， 戚 敏， 张 曦*

（1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；2.云南农业大学云南省动物营养与饲料重点实验室，云南昆明650201；3.云南省农村科技服务中心，云南昆明650201；4.云南农业大学基础与信息工程学院，云南昆明650201；5.云南省饲料工业协会，云南昆明650201）

蛋白质是维持机体生命活动所必需的营养物质，传统的蛋白质代谢模式认为蛋白质必须水解成游离氨基酸后通过氨基酸转运载体吸收入机体后被动物体吸收利用。然而，研究发现含2个或3个氨基酸的小肽是蛋白质水解的主要产物（Adibi，1973），并且其可以通过载体直接被吸收。许多试验证明，蛋白质在降解为氨基酸的过程中产生的中间体小肽可被动物体直接吸收（Agar，1953）。小肽能在肠道转运载体协助下直接被完整的吸收，具有吸收速度快、载体不易饱和、耗能低且效率高的特点，而且以小肽形式供给氨基酸可以避免游离氨基酸因竞争结合位点而造成的抑制效应，从而促进蛋白质饲料的吸收及转化（Gilbert，2008；Hara，1984）。本试验以鸡肉为原料，探索盐酸水解方法制备2～3个氨基酸组成的鸡肉小肽产品的工艺条件，并通过正交试验以期获得最优水解工艺条件，为鸡肉深加工利用研制出一种营养丰富，安全可靠的小肽产品。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 鸡肉，购至市场，切碎用搅拌机进行搅碎后供水解使用。

1.1.2 试验仪器 全自动凯氏定氮仪（SKD-1000），上海沛欧分析仪器有限公司；pH计（pHS-3D），上海精密科学仪器有限公司。

1.1.3 试剂 中性甲醛溶液（36%），应不含有聚合物，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH为7.0；0.1 mol/L硫酸标准滴定溶液；0.05 mol/L氢氧化钠标准溶液。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验采用正交试验设计，在110℃的温度下分别对水解时间（4、6、8 h）、盐酸浓度（2、4、6 mol/L）、料液比（1∶2、1∶3、1∶4）3个因素3个水平的正交试验设计，共9组，见表1。以肽链长度为指标确定鸡肉小肽的最佳水解工艺参数。

1.2.2 样品制备 取（2.50±0.0001）g鸡肉于水解管中，按表1中添加不同浓度、不同体积的酸溶液，抽真空后用喷灯将水解管管口封严，置于（110±1）℃烘箱中水解不同的时间。取出水解管，待其冷却后切开，用定性滤纸过滤至25 mL容量瓶内，定容至刻度。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 总氨基态氮的测定 采用甲醛滴定法进行测定，吸取5 mL水解液，加50 mL水，置于100 mL烧杯中开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/L）滴定至酸度计指示pH 8.2，加入10.0 mL中性甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准溶液（0.05 mol/L）继续滴定至pH 9.2，记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05 mol/L)的毫升数。试样中总氨基态氮的含量按下式进行计算（陈钧辉等，2008）。

表1 正交试验设计表L9（33）

式中：X为试样中总氨基态氮的含量，mg/g；V1为测定试样加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V2为空白试样加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积，mL；V3为试样取用量，mL；V4为水解液定容体积，mL；m为鸡肉样品重量，g；c为氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014为与1.00 mL氢氧化钠标准滴定溶液（1.00 mol/L）相当的氮的质量，g。

1.3.2 总氮含量的测定 采用全量凯氏定氮法，吸取5 mL水解液到消化管底部（不要黏在管壁内），加入0.4 g无水硫酸铜、6 g无水硫酸钾和10 mL浓硫酸，置于消化炉上加热，消化到颜色由淡黄色变成透明的蓝绿色并无黑色杂质时停止消化，待消化管在消化炉中冷却到室温时，取下消化管并加入少量的蒸馏水（农业部人事劳动司，2008），上机待测。

原料中的总氮含量计算公式如下：

式中：X为试样中总氮含量，mg/g；V1为滴定试样时所消耗的硫酸体积，mL；V2为滴定空白试样时所消耗的硫酸体积，mL；V3为试样取用量，mL；V4为水解液定容体积，mL；m为鸡肉样品重量，g；c为硫酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；0.014为与1.00 mL硫酸标准滴定溶液（1.00 mol/L）相当的氮的质量，g。

每个容量瓶做2个平行测定，以其算数平均值为结果。

1.3.3 氮水解回收率的计算 氮回收率是指蛋白质在水解过程中氮的损失程度，计算公式为：

式中：N1为凯氏定氮法测定的水解液中的氮含量，g/mL；V为水解液的总体积，mL；N2为凯氏定氮法测定鸡肉中的氮含量，g/g；m为鸡肉样品的质量，g。

1.3.4 水解度的计算公式（杨文博，2014）

式中：总氨基态氮采用甲醛滴定法进行测定；总氮含量采用凯氏定氮法进行测定。

1.3.5 平均肽链长度的估计（Adler-Nissen，1986）

APL≈1/DH×100%。

设定APL为水解后可得到的多肽的平均链长。本试验拟制备2～3个氨基酸残基的鸡肉小肽，2～3个氨基酸残基的鸡肉小肽的平均肽链长应为2～3，因此选定水解度为33%～50%时能满足鸡肉小肽的要求。

1.3.6 肽分子平均相对分子质量（Suh，2000）（PMW） PMW计算公式如下：

PMW=平均肽链长度×氨基酸平均相对分子质量；

式中：氨基酸平均相对分子质量为120。

2 结果与分析

2.1 不同水解条件对鸡肉氮水解回收率与水解度的影响 由表2可知，不同水解条件对各理组间的氮水解回收率、氨基态氮、总氮和水解度有显著的影响（P＜0.05）。从氮水解回收率来看，组1、组4的氮水解回收率比较低，显著低于其余7个组的氮水解回收率 （P＜0.05），较组3显著降低33.04%、33.66%（P＜0.05）。

从水解度来看，水解条件对组3、组5、组6、组8与组9的水解度影响不大（P＞0.05），但与组1的水解度相比分别显著提高29.2%、27.4%、24.9%、30.94%、33.48%（P＜0.05）；水解条件对组2与组4间的以及组2与组7间的水解度没有显著影响（P＞0.05），但与组1的水解度相比分别显著提高13.8%、8.25%、17.3%（P＜0.05）。

2.2 不同水解条件对鸡肉小肽平均肽链长度和小肽平均分子量的影响 由表3可知，水解条件对各试验组间平均肽链长度（APL）、PMW两个指标都有显著的影响（P＜0.05），组1的平均肽链长度、肽分子平均相对质量显著高于其余组（P＜0.05），而组4的平均肽链长度、肽分子平均相对质量显著低于其余组（P＜0.05）。水解条件对组3、组6、组8、组9间平均肽链长度、肽分子平均相对质量影响显著（P＜0.05），与组1相比平均肽链长度分别减少1.34、1.4、1.38、1.56，肽分子质量减少159.83、146.08、164.67、171.98。水解条件对组2、组7间平均肽链长度、肽分子平均相对质量没有显著影响（P＞0.05）。

2.3 不同水解条件对水解效果的主效应分析为比较不同水解条件对总氨、总氨基态氮含量、氮水解回收率、水解度等因素影响的主次顺序，采用极差方法，以极差值大小确定各因素的影响主次顺序，结果见表4。

表2 不同水解工艺水解结果比较分析

表3 鸡肉小肽平均肽链长度和小肽平均分子量比较分析

表4 不同水解条件对水解效果指标的主效应分析表

从表4看出，水解时间、盐酸浓度、料液比3个水解条件对氮水解回收率、总氮两个指标的影响主效应是一样的，即盐酸浓度＞料液比＞时间，水解时间、盐酸浓度、料液比3个水解条件对氨基态氮、水解度、平均肽链长度、肽分子平均相对分子质量4个指标的影响主效应也是一样的，即盐酸浓度＞时间＞料液比。

为了更直观的反映水解条件对试验指标的影响规律和趋势，以水解条件为横坐标，以试验指标的平均值为纵坐标，绘制指标的趋势图（图1～图6）。

图1 水解条件对总氮的影响趋势图

图2 水解条件对氨基态氮的影响趋势图

图3 水解条件对水解度的影响趋势图

图4 水解条件对氮回收率的影响趋势图

图5 水解条件对平均肽链长度的影响趋势

图6 水解条件对肽平均分子量的影响趋势图

从图1～图6中可以看出，水解时间、盐酸浓度、料液比3个水解条件对总氮、氨基态氮、水解度、氮回收率的影响趋势是相同的，即随着水解时间的延长、盐酸浓度、料液比的增加，总氮、氨基态氮、水解度、氮回收率也随着增加；而平均肽链长度、肽平均分子质量则逐渐减小，说明随着水解条件的变化，蛋白质逐渐被水解为不同肽链长度的小肽，底物蛋白质分解增多，但是蛋白质分解成的肽也进一步降解为氨基酸，从而肽含量增加程度减小。

3 讨论

研究中设计的水解时间、盐酸浓度和料液比3个水解条件中，盐酸浓度是影响试验指标的主要因素。这是由于溶液中氢离子浓度越高，则蛋白质肽键被切断的可能性越大，酸量的增加必然提高了酸对蛋白质的作用能力（马永全等，2010）。马永全等（2010）采用酸法水解河蚬蛋白质，以水解度为指标，通过对盐酸、柠檬酸、乳酸的单因素试验，确定选用5%盐酸可获得较好的水解效果，通过盐酸的优化正交试验，选择水解时间、温度、盐酸用量、料液比4因素3水平的正交设计，得到河蚬蛋白质酸水解的最佳条件为：盐酸用量5.5%，温度100℃，水解时间9 h，料液比1∶3，河蚬蛋白质水解度达到59.34%，盐酸水解河蚬蛋白质时，蛋白质水解度随着盐酸用量的增加而呈上升趋势，与本试验获得的趋势一致。方富永等（2009）利用6 mol/L的HCl溶液对波纹巴非蛤肉进行水解发现，波纹巴非蛤肉中氨基酸含量丰富，包括人体必需的7种氨基酸。而且，鲜味氨基酸丰富，可用于制作营养丰富的氨基酸口服液或高级调味料。陈晓刚等（2011）采用响应面分析法对酸水解制备波纹巴非蛤小分子肽工艺进行优化，获得的最优酸水解条件为：固液质量比1∶3、盐酸浓度6.4 mol/L、酸水解温度92℃、酸水解时间5.3 h，在此条件下肽得率为82.21%，与盐酸浓度固定为6 mol／L的条件下，随着酸水解温度的升高，肽得率呈先上升后下降的趋势，主要是因为温度过高，小分子肽开始大量地进一步分解为游离氨基酸，导致肽得率下降。乔伟等（2006）用6 mol/L的盐酸水解大豆分离蛋白质，得到适宜的水解条件为温度90℃，水解时间5 h，终产物中二肽和三肽含量为19.38%。李培骏等（2006）研究发现，水解度控制是水解过程的关键，预制备含3～8个氨基酸残基的小肽水解物，即水解度控制在10.0%～34.0%。邓勇等（2001）利用葡聚糖凝胶（Sephadex G-25）柱层析和高压液相色谱（HPLC）测定大豆多肽分子质量与水解度的关系，随着大豆蛋白质水解度的增加，大豆多肽混合物的分子质量变小，用水解度估算的大豆多肽混合物分子质量与理论计算相符，进一步验证了利用水解度判断肽分子质量的可行性。本试验所得水解产物中因含有大量的酸，若能去除其中的酸，则可提高水解物中的肽含量，提高实际的应用效果。

4 结论

盐酸浓度是决定水解效果的主要因素，水解2～3个氨基酸为主的鸡肉小肽的最优水解工艺条件为：盐酸浓度4mol/L，料液比1∶3，水解时间4h。在最优工艺条件下，鸡肉中的氮水解回收率为81.79%。