补脾益肾起痿汤对EAMG大鼠辅助性T细胞相关因子的影响

张运克，刘冲冲

(1.河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000;2.河南中医药大学，河南 郑州 450046;3.北京中医药大学，北京 100029)

补脾益肾起痿汤是全国第三、四批名老中医郑绍周教授多年来治疗重症肌无力的经验方，以补中益气汤和二仙汤化裁而成，经多年的临床研究，对肌无力辨证为脾肾亏虚型的有效率达80%以上。为了探讨本方治疗肌无力的作用机理，我们通过采用人工合成免疫原制作实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠模型，采用抗原包被法测定大鼠血清AChR-Ab水平；应用ELISA法检测大鼠胸腺及脾脏组织液中IL-2、IL-6、IL-17A和IFN-γ的浓度变化，初步探讨补脾益肾起痿汤通过调节辅助性T细胞相关因子治疗MG的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康lewis雌性大鼠72只，年龄42～62天，体质量150～160 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：11400700140544。河南省医药科学研究院SPF级实验动物中心饲养。将大鼠按随机数字表分为空白对照组、模型组、强的松对照组、补脾益肾起痿汤高中低3个剂量组共6个组，每组大鼠12只。

1.2 主要试剂和仪器

人工合成免疫原：人工合成鼠源性AChR-α亚基97～116肽段序列由上海淘普生物科技有限公司合成。规格：6 mg/支，分子量：2 252.62，纯度：98.67%，序列号：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐剂(CFA):购自美国Sigma公司,规格：10 mL/瓶，货号：F-5881；不完全福氏佐(IFA)：购自美国Sigma公司,规格：10 mL/瓶，货号：F-5506；磷酸缓冲液(PBS)购于Solarbio公司；大鼠/IL-6 、IFN-γ、IL-17A 、L-2 ELISA试剂盒购于达科为公司；iMark酶标仪购自北京友华照钦医疗器械有限公司。

1.3 实验药物

补脾益肾起痿汤由党参20 g，仙灵脾15 g，黄芪50 g，升麻15 g，柴胡15 g，生白术15 g，陈皮10 g，当归15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g组成，进行浓煎后装瓶备用，每毫升浓煎液含生药0.74 g。

对照药醋酸泼尼松片：H33021207，购于郑州大学第一附属医院药房。

1.4 实验模型制备

方法参考许文华[1]免疫乳剂的制备：由R 97～116、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混匀制成；首次免疫:取乳剂200 μL(含100 μgR97～116)，于造模鼠背部多点、足垫皮下注射，对照组给予同等剂量的佐剂与PBS混合乳剂。第2次及第3次免疫：首次免疫后第30天及第45天,造模组每只大鼠含多肽100 μg,与100 μLPBS充分混合后加入100 μLIFA在混匀机上搅拌20 min后，最终制成油包乳液,再取乳剂200 μL(含100 μgR97～116)强化接种，对照组同样注射等量PBS和佐剂，方法同首次免疫。

1.5 给药方法

将60只EAMG大鼠随机分为5组，每组12只给予灌胃治疗，其中模型组给予生理盐水每日3 mL，补脾益肾起痿汤高、中、低浓度组分别按64.8 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg·d)、16.2 mg/(kg·d)给予实验药物，西药组给予醋酸泼尼松片5.4 mg/(kg·d)，连续灌胃4周。另外12只空白组大鼠给予生理盐水每日3 mL。

1.6 实验指标的测定

1.6.1 组织液的制备

每组大鼠腹主动脉取血，离心15 min取血清，进行分装每管120 μL，-20℃保存备用。各取0.2 g脾脏、胸腺组织，分别加入0.3 mL生理盐水，进行匀浆，随后再加入0.2 mL生理盐水稀释，吸取组织液，放入3 mLEP管内，以转速2 500 rpm，离心20 min，取出细胞上清液，分装后放入-20℃冰箱。

1.6.2 大鼠血清中AChR-Ab浓度的测定

将血清提前放入4℃缓慢解冻10 h，观察有无沉淀，如有快速离心1 min，采用抗原包被法测定血清AChR-Ab水平。方法如下：将R97-116(5 μg/mL)100 μL/孔包被96孔板，4℃过夜。弃用包被液洗板，取10 μL血清放入990 μL的PBS中稀释，将每孔加入稀释后血清100 μL/孔，设置空白孔，37℃温浴30 min，期间取1 μL的辣根过氧化酶兔抗鼠IgG放入99 μL的PBS中稀释，取稀释好的液体20 μL放入3 980 μL的PBS继续稀释备用。温浴时间到达后洗板，之后加入稀释好的辣根过氧化酶兔抗鼠IgG 50 μL/孔37℃孵育30 min后洗板，加入底物和显色剂(1∶1)混合液50 μL/孔温浴10 min,再加入50 μL/孔2 mol/LH2SO4后采用酶标仪测定450 nm波长的吸光度值。

1.6.3 大鼠胸腺及脾脏组织液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的浓度的测定

采用ELISA法检测大鼠胸腺及脾脏组织液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ的浓度，具体检测方法按试剂盒操作要求进行。

1.7 统计学方法

2 实验结果

2.1 各组大鼠血清中AChR-Ab浓度

表1 各组大鼠血清中AChR-Ab 浓度(OD值)结果

注：与空白组相比，△P<0.01，与模型组相比，▲P<0.01

从表1可以看出，模型组血清中AChR-Ab 浓度明显升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。西药对照组及实验药物各剂量组均能够降低模型组大鼠血清中AChR-Ab浓度，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)；实验药物各剂量组与西药对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。实验药物高中低剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)，但随着药物浓度的增高，降低的幅度逐渐增强。

2.2 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IL-2浓度比较

表2 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IL-2浓度比较

注：与空白组相比，△P<0.01，与模型组相比，▲P<0.01

从表2可以看出，模型组大鼠胸腺及脾脏组织中IL-2浓度较正常组相比明显升高，两组相比有显著性差异(P<0.01)。实验药物高中低组能够降低模型组大鼠胸腺及脾脏组织液中IL-2浓度，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)；与西药对照组降低作用相比无显著性差异(P>0.05)。实验药物高中低剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)，降低IL-2浓度的幅度随实验药物的剂量增加逐渐增强。

2.3 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IL-6浓度对比

表3 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IL-6浓度比较

注：与空白组相比，△P<0.01，与模型组相比，▲P<0.01

从表3可以看出，模型组大鼠胸腺及脾脏组织中IL-6浓度较正常组相比明显升高，两组相比有显著性差异(P<0.01)。实验药物高中低组能够降低模型组大鼠胸腺及脾脏组织液中IL-6浓度，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)；与西药对照组降低作用相比无显著性差异(P>0.05)。实验药物高中低剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)，降低IL-6浓度的幅度随实验药物的剂量增加逐渐增强。

2.4 各组胸腺、脾脏组织液中IL-17A浓度对比

表4 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IL-17A浓度比较

注：与空白组相比，△P<0.01，与模型组相比，▲P<0.01

从表4可以看出，模型组胸腺、脾脏组织液中IL-17A浓度明显升高，与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。西药对照组及实验药物各剂量组均能够降低模型组大鼠胸腺、脾脏组织液组织液中IL-17A浓度，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)；实验药物各剂量组与西药对照组相比均无显著性差异(P>0.05)。实验药物高中低剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)，但随着药物浓度的增高，降低的幅度逐渐增强。

2.5 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IFN-γ浓度比较

表5 各组大鼠胸腺、脾脏组织液中IFN-γ浓度比较

注：与空白组相比，△P<0.01，与模型组相比，▲P<0.01

从表5可以看出，模型组大鼠胸腺、脾脏组织液中IFN-γ浓度较正常组相比明显升高，两组相比有显著性差异(P<0.01)。实验药物高中低组能够降低模型组大鼠胸腺、脾脏组织液中IFN-γ浓度，与模型组相比均有显著性差异(P<0.01)；与西药对照组降低作用相比无显著性差异(P>0.05)。实验药物高中低剂量组之间相比无显著性差异(P>0.05)，降低大鼠胸腺、脾脏组织液中IFN-γ浓度的幅度随实验药物的剂量增加逐渐增强。

3 讨论

MG是具有细胞免疫依赖性,体液免疫介导,补体参与,针对神经肌肉接头突触后膜上AchR的自身免疫性疾病[2]。辅助性T细胞通过分泌不同的细胞因子影响MG的发病。其主要亚型包括Th1、 Th2 Th17等。Th1细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)等，通过细胞因子网络的相互作用影响免疫应答,并辅助抗AchR抗体的产生。巨噬细胞及Th1细胞还直接损害NMJ及其AchR[3]。IL-2是参与免疫应答的关键因子之一，在MG的发病机制中起到促进机体抗体的产生，加速T、B细胞活化、增殖、分化，使其活性增强，又可以通过增强自然杀伤细胞的杀伤毒性而促进机体产生一系列的炎性反应[4]。INF-γ由活化的Th1细胞产生，是一种促进机体产生炎性作用的因子，是EAMG的中心效应分子之一。INF-γ可以激活抗原提呈细胞，使其进一步扩增，活化AChR特异性T细胞，促进B细胞的成熟，使其突触后膜的乙酰胆碱抗体增加，从而引起NMJ的失调[5]。在MG发病过程中，INF-γ表现活跃，作为AChR-ab生成的必要因子，也作为驱动因子,能加速INOS的活化，导致NO大量生成，参加细胞毒性作用，使EAMG大鼠NMJ处产生免疫损伤[6-7]。Th2细胞分泌IL-6等,与Th1相关的IFN-γ协同,辅助AchR特异性的B细胞增殖并产生抗AchR抗体[8]。IL-6参与B细胞成熟分化成浆细胞，并通过IL-6R而发挥生物学效应，是诱导免疫球蛋白产生的必需因子之一，能通过T细胞促进IL-2表达，研究表明，在MG患者中，发现血清IL-6表达明显高于正常人，随着患者症状的减轻，血清亦IL-6水平下降[9]，IL-6在MG发病中起促进作用[10]。Th17细胞主要分泌IL-17A等细胞因子[11]。IL-17是急性反应性细胞因子，IL-17A是该家族的成员之一，能够诱导促炎因子(如IL-6,TNF)以及趋化因子表达，使更多的免疫细胞到达炎症部位造成对机体的损害[12]。IL-17A对T细胞的活化起协同刺激作用，并能促进树突状细胞的成熟，并在多种自身免疫性疾病中起到重要作用[13]。 IL-17A，参与自身免疫反应、过敏反应、肿瘤免疫以及对抗细菌和真菌感染的宿主防御反应[14]。Mu 等[15]报 道 EAMG 存 在 Th1、Th2、Treg 及Th17 细胞比例的失调。由此可见，MG的发生并不是单一因素的参与，而是多种因素形成的瀑布链，共同导致MG的发病。

补脾益肾起痿汤由补中益气汤合并二仙汤君药组成，补中益气汤作为补益脾胃的代表方，具有升提中气的作用，对于“中气下陷”的肌无力(痿证)具有明显的临床疗效，符合“治痿独取阳明”原则。徐鹏等[16]采用系统评价方法发现，补益脾胃的中药可调控免疫相关细胞因子如IL-4、 IL-6、 IFN-γ、 TGF-β、TNF-α的变化，改善自身免疫性重症肌无力动物症状。吴周烨等[17]报道：黄芪、柴胡、升麻、桔梗等升提药物可以改善Rα97-116免疫Lewis大鼠构建的EAMG模型临床症状及体质量下降趋势，其机制可能是升高TGF-β含量，降低IFN-γ、IL-17含量。二仙汤君药仙茅、仙灵脾具有补肾精、助肾阳的作用，和补中益气汤合用适用于慢性缓解期重症肌无力的作用，符合“补北”治疗痿证的治则。张丽香等[18]报道：以补中益气汤联合补肾药物组成的温肾健脾方对重症肌无力患者增高的IL-6有明显的降低作用。从本研究的结果来看，补脾益肾起痿汤通过降低人工合成免疫原制作实验性自身免疫性重症肌无力(EAMG)大鼠模型胸腺及脾脏组织液中IL-2、IL-6、IL-17A、IFN-γ浓度，影响辅助性T细胞平衡，降低了血清AChR-Ab含量，起到拮抗炎症反应，减轻肌无力症状的作用。本研究从影响辅助性T细胞平衡的免疫作用方面，揭示了补脾益肾中药复方治疗重症肌无力(痿证)的作用机理，为该类方药的临床应用奠定药理学基础。