微粒皮种植对糖尿病足创面组织中AGEs、RAGE表达水平的影响

戚世玲 朱定衡 敖 贤 黄桃源 何仁亮

微粒皮种植因其操作简便、创伤较小被广泛应用于烧伤、压疮、糖尿病溃疡等多种慢性难愈合创面的临床治疗中，且取得了良好的临床疗效[1-3]，但具体作用机制尚不明确。研究显示，晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products，AGEs)及晚期糖基化终末产物受体(receptor of advanced glycation end products，RAGE)与糖尿病患者的血管及神经病变密切相关，因此，笔者于本研究中观察了微粒皮种植治疗糖尿病足后，创面组织中AGEs及RAGE的变化规律，探讨了微粒皮种植对糖尿病足患者创面组织中AGEs及RAGE表达水平的影响，以期为微粒皮种植治疗糖尿病足的临床应用提供理论依据。

1 临床资料

1.1 一般资料

本组患者共21例，均为2016年1月至2018年1月广州医科大学附属第五医院皮肤科及南方医科大学皮肤病医院皮肤外科收治的Wagner 3～4级糖尿病足患者，其中男性9例、女性12例，年龄59～74岁[(59.8±16.5)岁]，糖尿病病程(8.3±7.5)年，糖尿病足病程(51.3±49.4)d，糖化血红蛋白(9.9±4.2)%，Wagner分级为3级者12例、4级者9例。本研究经广州医科大学附属第五医院及南方医科大学皮肤病医院伦理委员会批准，且所有患者均签署了知情同意书。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：符合Wagner 3～4级糖尿病足诊断标准者；局部创面经常规处理无好转或恶化者；对本研究知情，并自愿签署知情同意书者。

排除标准：近半年出现过急性心肌梗死、脑梗死或脑出血者；患有严重心、肺、肝、肾等重要器官疾病者；患有恶性肿瘤者；患有精神疾病，不能配合治疗者[2]。

1.3 主要试剂与仪器

鼠抗人AGEs及RAGE ELISA试剂盒：Santa Cruz Biotechnology公司生产；全波长酶标仪：Thermo Scientific公司生产；BCA蛋白定量试剂盒：Pierce公司生产；超声匀浆器：Pro Scientific公司生产；低温离心机：Beckman公司生产。

2 方法

2.1 创面处理

患者入院后，在给予其调节血压及血糖、抗血小板聚集、改善微循环、营养神经、抗感染等综合治疗的同时，局部创面于清除焦痂、脓痂及坏死组织后，以间隔3～5 mm、深2～3 mm为准用眼科无齿镊将微粒皮(微粒皮制作方法如下)种植于创面，并覆盖无菌纱布加压包扎。每天观察创面变化，并用安尔碘(Ⅲ型)消毒及生理盐水冲洗后更换无菌纱布。

微粒皮制作：常规选取供皮区消毒麻醉后，以取皮面积∶创面面积为1∶20～30为准切取韧厚皮片，并于无菌生理盐水中将其剪成边长为1～2 mm的矩形微粒皮。供皮区创面用无菌纱布加压包扎，每天换药1次，直至创面愈合。

2.2 标本采集

分别于治疗前及治疗第7、14天测量创面面积，并取创面肉芽组织置于-80 ℃的冰箱内冷冻保存备用。

2.3 创面组织中AGEs及RAGE的含量测定

按照试剂盒说明书采用BCA 法检测创面组织中的总蛋白含量、采用酶联免疫吸附法检测创面组织中AGEs及RAGE的表达水平，并以AGEs及RAGE的表达水平与总蛋白含量的比值作为每100 μg创面组织中AGEs及RAGE的含量(ng/100 μg)[4]。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 治疗结果

治疗前，21例患者创面面积为(11.32±12.61)cm2。治疗过程中，所有患者创面均逐渐缩小，其中治疗7 d后，21例患者创面面积为(9.13±10.42)cm2；治疗14 d后，21例患者创面面积为(6.49±9.85)cm2；治疗60 d后，18例患者创面完全愈合、3例患者创面明显缩小。典型病例图片见图1-3。

3.2 治疗前后创面组织中AGEs及RAGE的含量对比

治疗过程中，21例患者创面组织中AGEs及RAGE的含量均呈逐渐下降的趋势，其中各时间点创面组织中AGEs含量对比，P均<0.01，差异具有统计学意义；RAGE含量对比，除治疗前与治疗第7天对比，P>0.05，差异无统计学意义外，其余各时间点对比，P均<0.01，差异具有统计学意义(表1)。

表1 治疗前后21例患者创面组织中AGEs及RAGE的含量对比Table 1 Content comparison of AGEs and RAGE in wound tissues of the 21 patients before and after treatment(ng/100

注：各时间点创面组织中AGEs及RAGE的含量对比，其中与治疗前对比，aP<0.01，差异具有统计学意义；与治疗第7天对比，bP<0.01，差异具有统计学意义

Note: The contents of AGEs and RAGE in wound tissues were compared at each time point, of which the comparisons with that before treatment showed statistically significant differences(aP<0.01), and the comparisons with that on day 7 of treatment also showed statistically significant differences(bP<0.01)

4 讨论

临床研究证实，微粒皮种植是一种可以重复操作的新型创面修复方法，对手术条件、患者身体条件等的要求相对较低，且创面愈合效果较好，可明显降低患者的痛苦及致残率[5-7]，特别是将其与其他药物联合应用后，显著提高了创面的治疗效果，如与重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、高分子生物复合膜等联合应用后，明显提高了微粒皮的成活率[8-9]，加快了创面的愈合速度。但有关微粒皮种植促进创面愈合的作用机制却鲜见报道。

研究显示，血管及神经病变、感染、细胞代谢及免疫功能紊乱等是糖尿病足发生及发展的基础[10]，而高血糖状态下，糖、蛋白质及脂质等的非酶糖基化产物AGEs与其受体RAGE形成的复合物直接参与了糖尿病患者血管及神经等的病变过程[11-12]，如AGEs与RAGE形成的复合物可通过启动受体信号转导通路增强血管内皮细胞的通透性，从而增加血管细胞黏附分子的表达水平，促进巨噬细胞的浸润及炎症细胞因子的分泌，抑制中性粒细胞的趋化及迁移，引起血管内皮损伤、神经元功能紊乱等[13]；高血糖状态下，AGEs可在创面局部堆积，进而引发白细胞介素(Interleukin，IL)-1、 IL-6、肿瘤坏死因子等炎症细胞因子增加，致使糖尿病足创面经久不愈[14-17]；RAGE可维持和促进炎症的发生及发展，从而影响糖尿病足创面的愈合[18-20]；降低糖尿病足患者创面组织中AGEs及RAGE的表达水平后，创面组织中中性粒细胞浸润减少，血管内皮生长因子增多，创面愈合速度加快[21-22]。

鉴于以上原因，笔者为探究微粒皮种植促进糖尿病足创面愈合的作用机制，于本研究中观察了微粒皮种植治疗糖尿病足后，创面组织中AGEs及RAGE的变化规律。结果显示，治疗过程中，21例患者创面组织中AGEs及RAGE的含量均呈逐渐下降的趋势，其中各时间点创面组织中AGEs含量对比，P均<0.01，差异具有统计学意义；RAGE含量对比，除治疗前与治疗第7天对比，P>0.05，差异无统计学意义外，其余各时间点对比，P均<0.01，差异具有统计学意义。即微粒皮种植治疗可能能够降低糖尿病足创面组织中AGEs及RAGE的表达水平，促进创面愈合。

综上所述，微粒皮种植治疗促进糖尿病足创面愈合的作用机制可能与AGEs及RAGE水平的下调有关，可进一步深入研究探索，予以明确。另外，创面的修复过程还与基质蛋白水解酶、感觉神经肽P物质、血管内皮生长因子、一氧化氮、缺氧诱导因子等多种因素相关，因此微粒皮种植治疗糖尿病足的具体作用机制尚需多因素大样本深入研究。