几种生防细菌对尖孢镰刀菌的抑菌效果及其相互间包容性生长的快速检测①

孙茜茜 李春强 易小平

(中国热带农业科学院热带生物技术研究所/农业农村部热带作物生物学与遗传资源利用重点实验室 海南海口571101)

茄子枯萎病和香蕉枯萎病都是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的真菌性病害。茄子枯萎病是茄科蔬菜的主要病害，近年来有加重趋势。香蕉枯萎病是目前香蕉最严重的病害，制约着香蕉产业的可持续发展。枯萎病的防治方法虽有多种，抗病品种选育是关键，但进程缓慢，作物也会随着病原菌的致病性变异而重新染病；化学防治简单快速，却易造成环境污染，病原菌易产生抗药性等副作用；目前生物防治安全、高效，越来越受到人们的关注［1]，是值得推广的防治方法。微生物菌剂的应用是生物防治的重要方面，通过生防菌的生命活动，使土壤酶活性增强，难溶性矿物养分被分解，或通过分泌植物激素［2]，增加植物养分的供应量和促进植物生长［3]，或改变根际菌群主导微生物群落，从而减少病原体在植物根际的定殖等［4]。生防菌筛选一直是病害防治的重要方面，微生物菌剂具有良好的应用前景。

芽孢杆菌（Bacillus）是一类好氧或兼性厌氧的能形成抗逆性芽孢（内生孢子）的杆菌，具有种类多、繁殖快、抗逆性强等特点，芽孢杆菌属的各类有益菌株在工业、农业及医学等科学领域有着广泛的应用价值。目前应用广泛的芽孢杆菌各有不同的功效，如枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）会产生多肽类活性物质和生物表面活性素，对致病菌有明显抑制作用；胶冻样芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus） 主要用于固氮、解磷、解钾，增进土壤肥力，提高营养元素；地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）对灰霉病菌和炭疽病菌有抑制作用［5]；巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）作为溶磷菌，可以提高作物产量；解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amylo‐liquefaciens）具有促生、防病及定殖能力。本实验室先前分离筛选了8 种生防菌，分别是JK01菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，现针对茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.melongenae）和香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cubense）两种病原真菌拮抗菌株进行初步筛选，以期寻找合适的微生物菌剂可以有效防治茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌。结合生防菌的不同特性，并测定菌株间是否能够包容生长，为进一步开发混合微生物肥料奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株：茄子枯萎病菌尖孢镰刀菌茄子专化型（Fusarium oxysporumf. sp. melongenae，Fom）由福建农科院肖荣凤老师惠赠；香蕉枯萎病菌尖孢镰刀菌古巴专化型4 号小种（Fusarium oxysporumf.sp.cubenserace 4，Foc4）本室分离保存；生防菌为JK01 菌、JK02 菌、JK2015 菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，均由本室分离保存。供试培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、LB固体培养基。

1.2 方法

抑菌试验：采用平板对峙法进行8种生防菌对茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌活性测定。分别将茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌菌饼接种于PDA 固体平板中央，在距离菌饼2.5 cm 处接种细菌菌株，3 次重复试验，以不接种生防菌的病原菌作为对照，在28℃恒温培养箱中培养。接种5 d 后，采用十字交叉法测量各处理菌落直径（即：每个菌落横着测一次竖着测一次求平均值，目的是减小误差，因为菌落并非都是正圆形的；如果遇到有的椭圆型菌落横竖测量值相差大于1 cm，将舍弃此数据，以其它重复计算）。抑制率计算参照文献［6]进行，具体计算公式为：抑制率＝［对照菌落扩展直径（mm）－处理组菌落扩展直径（mm）]/对照菌落扩展直径（mm）×100%，其中：菌落扩展直径（mm）＝菌落测量直径（mm）－菌饼直径（mm）。采用SPSS 软件进行数据统计分析，利用Duncan 氏新复极差法进行差异显著性分析。包容性生长测试：用接种环分别对8 种生防菌进行LB 固体平板划线，在28℃恒温培养箱中培养3 d 后，挑取单菌落，并接种于LB 液体培养基中进行摇菌活化。将已活化的8 种生防菌菌液，采用三三组合方式在LB 固体平板上划线，划线的3种细菌尽量靠近但不贴在一起，3 个重复；然后28℃培养2 d 后，观察彼此之间是否能生长在一起。若彼此之间能够融合生长，或菌斑边缘界限虽然清楚但能够重叠生长在一起（可能是一种共处关系），则认为彼此之间能够包容生长，标记为“＋”；若彼此之间有明显的抑制，即菌斑边缘界限较大或不能生长在一起，而且有明显的排它性，则认为彼此之间不包容生长，标记为“－”。

2 结果与分析

2.1 8种生防菌的抑菌效果

2.1.1 生防菌对茄子枯萎病菌的抑菌效果

8 种生防菌对茄子枯萎病菌的抑菌效果见图1。

图1 8种生防菌对茄子枯萎病菌的抑制效果

从图1可以看出，巨大芽孢杆菌对茄子枯萎病菌生长无明显抑制作用，抑菌率只有6.1%。地衣芽孢杆菌对茄子枯萎病菌和也无明显抑菌作用，抑菌率只有3.48%。其余6 种生防菌对茄子枯萎病菌都有抑菌效果，抑菌率为28.99%～52.54%，抑菌效果JK2015 菌＞胶冻样芽孢杆菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢杆菌＞解淀粉芽孢杆菌（见表1）；其中JK2015菌的抑菌活性（抑菌率为52.54%）显著高于胶冻样芽孢杆菌（抑菌率为48.48%），胶冻样芽孢杆菌抑菌活性显著高于JK01 菌（抑菌率为43.24%），JK01 菌和JK02 菌（抑菌率为46.11%）抑菌活性显著高于枯草芽孢杆菌（抑菌率为34.42%）；枯草芽孢杆菌显著高于解淀粉芽孢杆菌（抑菌率为28.99%）。

2.1.2 生防菌对香蕉枯萎病菌的抑菌效果

8 种生防菌对香蕉枯萎病菌的抑菌效果见图2。

图2 8种生防菌对香蕉枯萎病菌的抑制效果

从图2可以看出，巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌Foc4 均无明显抑菌作用，抑菌率分别只有6.3%和7.25%；其余6 种生防菌对Foc4都有一定的抑菌效果，抑菌率为54.92%～70.45%不等，抑菌效果JK2015 菌＞胶冻样芽孢杆菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢杆菌＞解淀粉芽孢杆菌（表1）。其中JK2015 菌的抑菌活性和胶冻样芽孢杆菌差异不显著，JK02 菌的抑菌活性和JK01 菌差异不显著，但是前两者抑菌活性都显著高于后两者，JK2105、胶冻样芽孢杆菌、JK02 菌和JK01菌抑菌率分别为70.45%、69.29%、66.35% 和65.92%；JK01 菌和JK02 菌的抑菌活性显著高于枯草芽孢杆菌菌（抑菌率为61.10%）；枯草芽孢杆菌显著高于解淀粉芽孢杆菌（抑菌率为54.92%）。

表1 8种生防菌对茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌率测定结果 单位：%

2.2 8种生防菌包容性生长试验

对JK01 菌、JK02 菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、JK2015菌8种生防菌相互间是否能够包容生长进行了测定，结果见图3、4。结果表明，JK01 菌不能与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌包容生长；JK02 菌不能与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌包容生长；枯草芽孢杆菌不能与JK01 菌、JK02 菌、胶冻样芽孢杆菌包容生长；而其余菌株之间均可以包容生长。其中，巨大芽孢杆菌与其它菌株均可以包容生长；地衣芽孢杆菌与其它菌株均可以包容生长；JK2015 菌与其它菌株均可以包容生长；胶冻样芽孢杆菌除不能与枯草芽孢杆菌包容外，与其它菌株均可以包容生长。

3 讨论与结论

我国农业长期过度依赖化肥，土壤生态质量遭到严重破坏，采用生物防治的方法防治植物病害已成为大趋势。选用多种能够包容性生长的生防菌，配成混合菌剂并结合田间试验以获得广谱高效的、易于培养的微生物菌剂或微生物肥料，对于植物病害的防治具有重要意义。为了减少化肥和化学农药使用，近年来复合微生物菌剂在农业生产中越来越发挥着重要作用。叶乃玮等［7]发现，组合木霉菌可湿性粉剂比单一木霉菌更能显著降低香蕉枯萎病的病情，同时还利于提高香蕉产量。研究发现在常规施肥基础上施用复合微生物菌剂对作物花椰菜、茶叶、葡萄、翠冠梨都有较好增产增收效果［8]。采用复合微生物菌剂与氨基酸水溶肥组合能有效抑制根结线虫的增长和根结的形成，抑制率高于90%［9]。但是，了解各微生物之间能否包容生长对其在农业生产上的应用十分重要。

图3 8种生防菌间的包容性生长统计结果

为了解生防菌之间的生长是否相互影响，采用平板划线共培养，开发出一种快速检测方法，对8种生防菌之间的包容性做出快速初筛，结果发现：JK01 和JK02 不能与枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌包容生长，枯草芽孢杆菌不能与胶冻样芽孢杆菌包容生长，其余菌株间都可以包容生长。微生物包容生长机制比较复杂，但一般认为，微生物之间的生长不受对方影响就认为包容，当然有的还能互相促进，如由巨大芽孢杆菌和氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacterium oxydans）等伴生菌的维生素C发酵中，后者难以单独培养，而前者可以为后者提供生产因子和生物活性物质协助后者合成维生素C 前体2-酮基-L-古龙酸［10]。本研究中各生防菌间的关系及包容性只是初步结果，其作用机制有待进一步深入探究。

图4 8种生防菌间的包容性生长测试

同时，为明确几种生防菌对茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果，采用平板对峙法进行抑菌谱试验。结果表明，JK2015 菌对茄子枯萎病菌和香蕉枯萎病菌的抑菌效果最为明显，而巨大芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌对两种病原真菌均无明显的抑菌效果；对两种病原菌的抑菌效果为：JK2015 菌＞胶冻样芽孢杆菌＞JK02 菌＞JK01 菌＞枯草芽孢杆菌＞解淀粉芽孢杆菌。

上述结果，为微生物混合菌剂及茄子和香蕉专用生物肥料的开发奠定基础。