HLC-723G8 全自动HbA1 c分析仪测定的影响因素及对策

周冰 张如平

(贵州中医药大学第二附属医院检验科，贵州 贵阳 550003)

血红蛋白A是由4个亚铁血红素和2对α和 β珠蛋白链构成的四聚体。而血红蛋白A1 c则是血红蛋白A的 β链末端氨基酸残基与葡萄糖结合而成的HbA1 c。HbA1 c是由分两个阶段的非酶糖化反应所生成。第一步由葡萄糖和血红蛋白结合形成可逆的醛亚胺中间产物(不稳定型A1 c)，而后经过较长时间的不可逆反应形成稳定的基酮氨(稳定性A1 c)，这个最终产物也就是现在通常所检测的HbA1 c。我科于2017年购买一台HLC-723G8全自动糖化血红蛋白(HbA1 c)分析仪，通过一年多的临床应用，在这里我们对HbA1 c检测结果构成的影响相关因素进行探讨。

1 影响因素

1.1 检验方法 HbA1 c测定方法的原理有多种：(1)根据HbA1 c与Hb的电荷差异，如离子交换层析法、高效液相层析法(HPLC)、电泳和等电聚焦电泳法;(2)根据Hb上糖化集团结构差异，如亲和层析、免疫测定法、离子捕获法和酶法; (3)化学分析，分光光度法、比色法。

高效液相层析法(HPLC)是在全血状态下测试，酶法或免疫法则是将血液离心后从红细胞层进行采样。测定方法不同对HbA1 c的检测结果所产生的干扰也不同。

1.2 不稳定产物对检测的影响 L-A1c是HbA1 c在进行初期反应时所产生的一种产物，结构不是十分稳定，会随血糖浓度的变化而变化，可水解为葡萄糖和Hb，也可生成更稳定的醛胺。该物质不能对平均血糖的浓度进行反映，但可对HbA1 c的测定结果产生影响[1]。硼酸盐亲和色谱法和免疫法不对L-A1c进行检测，所以不会受其影响[2]。离子交换色谱法和电泳法受该物质的影响相对较大，有研究发现该物质可使离子交换色谱法测定得到的HbA1 c值比实际值高出1.5%左右[3]。最简单去除该物质的方法是将样本用溶血剂进行处理，将溶血产物在37 ℃水浴箱中孵育6 h左右[4]。

1.3 Hb变异体对检测的影响 HbF不会对离子交换色谱法和亲和色谱法的检测结果产生影响，而免疫法易受到HbF的干扰。研究发现即使HbF浓度在15%以上，Bio-Rad VariantⅡ和Tosoh G7两种离子交换层析柱也不会受到太大的影响[5]。但CLC330/385亲和层析柱法的测定结果会比实际值低，尤其当HbF在20%以上时，测得的HbA1 c值会下降1%左右，甚至更多。该物质对CLC330/385亲和色谱法所产生的干扰比较多，可能是由于HbF的糖化速率相对较慢。HbF可以使DCA-2000免疫法的测定值较实际值低，因为在HbF分子中HbA的β链被γ链所取代[6]。

1.4 常见的化学衍生物对检测结果的影响 氨基甲酰Hb在患有尿毒症的患者血液中的浓度会明显升高，是最常见的对HbA1 c检测结果造成干扰的化学衍生物[7]。尿素在患者体内可自发形成氨和氰酸盐化合物，氰酸盐经过质子化作用后可以形成异氰酸，该产物与蛋白质的α和ε氨基基团反应可以形成氨基甲酰。Hb的β链的N端上的缬氨酸与异氰酸发生结合反应形成氨基甲酰Hb[8]。该物质与HbA1 c的等电点比较相似，故可对依据电荷原理对HbA1 c的水平进行测定的方法形成一定的干扰。电泳法对氨基甲酰Hb的反应非常敏感。在患者的体内，氨基甲酰化的Hb的浓度如果在5.4%以上时，就会导致采用离子交换法测定得到的HbA1 c值比真实偏高[9]。

1.5 影响红细胞生存时间的因素对检测结果的干扰 HbA1 c在患者的红细胞内的合成进程是连续进行的， 但是速度一般情况下比较缓慢，任何一种能够导致机体内的红细胞寿命明显缩短的疾病都会使HbA1 c形成的时间显著缩短，使得检测所得到的最终结果受到一定程度的影响。由于某些基础性疾病多导致的继发性溶血现象，往往会导致该项检测所得到的最终结果明显偏低，例如患有肝硬化、脾肿大等疾病的患者。此外采用EPO(促红细胞生成素)进行治疗及处于极度贫血状态下的患者采用输血的方法进行治疗，也会对HbA1 c的检测结果造成很大的影响[10]。

1.6 药物的影响 维生素E可对Hb的糖基化产生十分明显的抑制效果，使测定所得到的最终结果出现假性降低现象。相关研究结果显示，患有缺铁性贫血的患者在血糖的浓度相对恒定、红细胞数显著减少的情况下，HbA1 c的测定值会显著升高，用铁剂(100 mg/d)对该类患者治疗3个月之后，由于幼红细胞的出现使得Hb的浓度显著降低，可以使HbA1 c平均值由7.0%下降至6.0%左右[11]，使测定所得到的最终结果出现假性降低现象。利巴韦林引起的溶血，使红细胞寿命缩短导致HbA1 c结果降低。血透病人的HbA1 c会下降，(但是用含葡萄糖的透析液作血透的肾衰病人会增高)。 采用EPO(促红细胞生成素)进行治疗时， 大量的红细胞增生，蛋白总量快速增加，而HbA1 c仍然以缓慢的速度生成，其与Hb总面积的百分比就相对偏低，导致HbA1 c结果偏低。

1.7 贮存温度对检测结果的影响 HbA1 c稳定性好，标本即使在室温下放置3～14 h也不会明显影响测定结果。潘月等[12]对不同温度条件下储存的全血标本进行了检测，全血标本4～8℃保存第7天时，所测得结果显著低于新鲜标本。在-20 ℃下储存第28天时，所测得结果也显著低于新鲜标本。因此，若全血标本不能及时测定，需将其放置4～8 ℃保存，并最好在15 h内进行测定，此时HbA1 c检测结果变异率<3%。在室温的条件下，样本的稳定性相对较差。

1.8 标本的质量 在HLC-723G8全自动HbA1 c分析仪的检测结果中有Total Area的信息，这是与注入层析柱的血液样本中总血红蛋白成比例的数值。Total Area应保持在适当的范围。如果注入的血液过于稀薄，Total Area过低会导致HbA1 c检测结果偏低。反之，如果血液过于浓稠，Total Area过高则会导致HbA1 c检测结果偏高，而通常在这种情况下，检测结果的增高可能会达0.5%～1%，甚至会导致层析柱的损伤。

1.9 抗凝剂乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)的影响 抗凝管测定HbA1c作为标准用管。抽血量1～3 mL，混匀，无凝块，抗凝管无破损。有报道使用肝素抗凝，结果会偏高。

1.10 某些疾病的影响 例如肝硬化：肝脏能使血糖浓度保持恒定，当餐后血糖浓度升高(>8.25 mmol/L)时，肝细胞迅速摄取葡萄糖并将其合成肝糖原贮存起来，当空腹时糖浓度降低至(<3.9 mmol/L)，肝糖原迅速分解生成葡萄糖补充血糖，还能进行糖异生参与血糖的调节， 肝硬化病人的血糖调节功能下降，常常会出现低血糖，从而导致HbA1 c生成偏低。

1.11 其他影响因素 年龄、种族、性别、空腹血糖、餐后2 h血糖等均是HbA1c测定准确性的独立影响因素。HbA1c与空腹血糖呈正相关，而空腹血糖水平随年龄增长有所增高，HbA1c检测结果也随之发生变化[13]。一般认为年龄与HbA1c值无关，但Pani[14]等对2473名正常人和3270 名血糖调节受损者进行HbA1c测定，在调查性别、体质量指数、空腹血糖、餐后2 h血糖等因素后，认为年龄每增加1 岁，HbA1c测定值升高0.03%。不同种族的HbA1c值不同， Herman[15]等对3819名血糖调节受损者测定， HbA1c 在调整年龄、性别、教育、婚姻、血压等多项影响因素后，美国白种人、西班牙裔人、亚洲裔人、印第安人的HbA1c平均值分别为5.78% 、5.93% 、6.00%、6.18%， 差异具有统计学意义。

2 对 策

2.1 了解仪器的性能，减少误差出现 HbA1c测定方法不少，不同方法，原理不同，其影响因素也不相同。检验工作人员应了解检测方法对于各种变异体检测的局限性以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并在报告中为医生作出提示。我院购进的HLC-723G8全自动HbA1c测定仪，其原理为高效液相层析法(HPLC)。测定HbA1c的百分含量，目前认为是分析HbA1c的金标准。要注意因血红蛋白变异体引起的误差。若遇到高度可疑地中海贫血和血红蛋白病的病人，在发出报告前须仔细检查色谱图确认可能存在的血红蛋白变异体，一旦发现结果出现偏差，可以采用变异模式，分离诸如HbS，HbC 等在HbAO峰后析出的变异血红蛋白，通过其峰面积的补正而获得更为准确的HbA1c检测结果。另外，仔细阅读厂商提供的使用说明书可避免发出一些不准确的结果。认真检查有无异常色谱图，提高操作仪器的技能和具备判断图谱的能力。

2.2 备注性检验报告 关注HbA1c的极度异常值以及HbA1c与血糖不一致的结果。如：对于某些血红蛋白异常偏低，疑似贫血患者，可以通过备注系统提示临床“该份标本检测贫血，影响HbA1c检测结果”。而对于血糖结果与HbA1c结果存在差异的样本，同样可以通过备注系统及时提醒临床进行复查。受检测仪器本身原理的影响，可能会受到异常血红蛋白的干扰而异常增高或显著偏低，对于此类样本，也应给出更为详尽的备注，内容包括提示存在异常血红蛋白干扰，建议用免疫法检测HbA1c，检测血红蛋白电泳等等。

因此，美国临床生化学会(NACB)要求当HbA1 c>15%或低于参考区间下限时应重复测定一次(最好用不同原理的方法)，以确定是否有血红蛋白变异体的存在[16]。

2.3 合理解释特定病人的HbA1 c检测结果 应清楚认识到某些药物和某些疾病会造成HbA1 c假性升高或降低。其中部分药物在临床上使用十分广泛，如服用水杨酸盐、维生素C、阿片类药物可引起假性升高。维生素E、病毒唑、α-干扰素可引起假性降低。某些疾病如：严重的高甘油三酯血症，严重的高胆红素血症、尿毒症、缺铁性贫血、铅中毒、长期饮酒均可引起假性升高。慢性肾病、肝硬化、妊娠初期可引起假性降低。当用HbA1c评估铁、维生素B12或叶酸缺乏引起的贫血的糖尿病病人的血糖控制情况时，应充分考虑HbA1 c结果可能存在假性升高，不能真实反映病人的平均血糖水平。在做出任何医疗改变前应要求病人在餐前和餐后2h连续检测毛细血管血糖水平数天，评估血糖自我监测结果是否与期望的HbA1 c水平一致，以避免潜在的不适当的治疗和降低低糖血症的风险。

2.4 替代指标的选择 在HbA1c不能准确反映血糖控制的情况下，使用替代指标是合适的选择。这些指标包括果糖胺、糖化白蛋白、1，5-脱水葡糖醇(1，5-AG)和连续葡萄糖监测(continuous glucose monitoring，CGM)。尽管果糖胺、糖化白蛋白、1，5-AG和CGM检测与平均血糖水平相关，重要的是要记住只有HbA1c是通过验证证明可作为评价长期血糖控制和并发症形成风险的测量指标，因此HbA1c仍是测量血糖控制状况的金标准，这些替代方法只能用于HbA1c结果不准确或误导的情况，或对HbA1c进行补充[17]。

2.5 仪器的维护 常规的日常维护包括过滤器、层析柱的使用、更换，定期适时的校准。

3 小 结

HbA1 c是指示血糖控制情况的金标准，同时也是贯穿糖尿病诊治过程中极为重要的管理基石。由于诸多因素均可以造成HbA1 c检测值的假性升高或降低，因而开展HbA1 c检测标准化工作极为重要。注重HbA1 c的检测质量，进一步关注细节，重视检测的所有过程，充分满足分析中各个环节的质量要求，更多贯穿落实HbA1 c的标准化，确保为临床提供更为准确、有效的检测结果。