油菜单倍体遗传转化的条件

申　敏

油菜单倍体遗传转化的条件

申敏

（长治职业技术学院山西长治046000）

小孢子作为一种单倍体材料可以进行外源基因遗传转化，这种方式可以加快转基因材料纯合速度，在染色体加倍后，导入的外源性状能以纯合体的形式体现。排除了隐性干扰，提高了选择的准确性。文章从单倍体概念及原理、转化的主要技术环节及其特点、后代鉴定等进行了分析。

单倍体；遗传转化；进展

油菜是一种重要的油料作物，现阶段大部分研究进行转化的材料大都是二倍体的组织，得到的转基因植株经常是杂合体[1]，在后代培养中容易造成外源基因的丢失，限制了在基因改良中的优势利用。

小孢子或是小孢子衍生胚、花粉和小孢子培育体系在多种有重要商业价值的高等植物中已经有过报道。依据小孢子本身的特性可以使得小孢子作为基因纯合的优良受体。在染色体加倍后，导入的外源性状能以纯合体的形式体现。这种方法还可以用来在经过了胚胎的基因转移和突变重新得到单个植株的同质植株。单倍体最关键的优点是转基因会使转化株马上表达转化性状，简化了遗传分析，增加基因剂量。单倍体转化技术已经被广泛应用于杂交后纯系品种快速繁殖。

1 油菜单倍体转化的外植体

小孢子衍生的胚、单倍体茎段、茎节间、茎段、叶柄、子叶下胚轴、原生质体和小孢子等各种外植体可以用在遗传转化实验。

小孢子再生能力非常强，后期更易获得需的材料。刚分离的小孢子作为转化受体选择主花序或第一次分枝花序3～4 mm的花蕾，在油菜花药培养中，只有单核晚期的小孢子可能发育成胚状体。在开花四天摘取3～4 mm的花蕾时，小孢子的发育一致性较好[2]。

对于甘蓝型油菜，从器官、组织、细胞三个水平研究了供体植株不同外植体部位再生情况及影响再生反应的一些因素，并对甘蓝型油菜小孢子来源的再生组培苗进行了倍性水平的鉴定[2]，结果表明，利用茎段节间再生腋芽是一种较好的快速再生植株方式，具有出芽快，遗传特性保持好的特点，茎段具有较强的分化芽能力，而叶柄和叶片难以诱导芽分化。

2 油菜单倍体转化的主要技术环节

2.1 农杆菌介导法

农杆菌转化中LBA4404 ，EHA101 已经成功获得油菜转化，农杆菌介导法在植物转基因育种中应用较为广泛：将所需接种的工程菌接种在YEB液体培养基中，摇床培养28 度震荡过夜，培养至对数期离心收集菌体，然后将液体培养基洗涤几次，再用NLN培养基重悬备用。

小孢子进行32 度热激处理使用农杆菌工程菌株侵染进行共培养。培养两天后，离心（2 000 r/min，3 min）收集共培养后的小孢子，将处理后的小孢子用新鲜的含100 mg/L的羧苄青霉素培养基暗培养直至小孢子长出肉眼可见的小胚状体，再将小孢子移接到筛选压（Kan 50 mg/L）的培养基上进行植株再生[3]。

农杆菌介导法是目前应用最广泛，适用范围最广的一种转化方法，农杆菌介导法在油菜转化中效率也很高[3]。

2.2 基因枪转化或微粒轰击法

使用PDS-1000 型高压基因枪轰击小孢子，根据预定参数参照说明书操作，金粉使用量为130 ul金粉，DNA使用量为0.7 ug。轰击以后暗处理16 h，再逐渐转入恢复培养基中。小孢子采用热激处理可以产生较高的胚状体分化率。

微粒轰击优点是：适用范围广，精确和实用。但是这个方法在油菜中并没有很普及，因为农杆菌接到法在油菜转化中效率同样很高[4]。缺点是：高速粒子进入细胞后会破坏细胞膜引起细胞损伤而且会导致乙烯积累。0.4 M甘露醇可以解决这个问题，浓度太高（0.5 M）会导致转化效率下降。较低的粒子轰击压力会得到稳定的转化。

2.3 影响小孢子与小孢子衍生胚再生的因素

小孢子预处理条件

（1）低温处理及处理时间：小孢子在与工程菌株共培养之前先低温处理刺激小孢子生长。

对供体材料小孢子进行低温预处理，发现小孢子胚胎再生能力显著提高，而不同的基因型预处理后发现低温处理时间越长小孢子的胚发育能力下降，表示低温处理影响小孢子的胚发育下降，胚胎发生率提高。

（2）消毒时间与浓度：在7 %的次氯酸钠溶液中表面消毒15 min，次氯酸钠浓度过高则花蕾脱水失去活性，浓度偏低则易污染。

（3）小孢子培养密度：在NLN13 液体培养基浅层培养时，小孢子最佳密度是（Φ60 mm*15 mm培养皿）是两个花蕾提取的小孢子，在加入多菌灵和链霉素的MS培养基，可提高成苗率，使用灭菌水处理冲洗，冲洗后再用少量培养基进行冲洗。培养基均用0.22 um滤膜过滤灭菌。用玻璃棒将花蕾研碎。尼龙网过滤，离心后沉淀小孢子。

（4）小孢子培养时间：小孢子培养三天作为转化受体比刚分化的小孢子作为受体进行诱变处理，培养三天的小孢子转化率明显增加，可能是培养三天后的小孢子已经向胚状体发育转化。其它培养条件比如说温度[5]，蔗糖浓度不同等条件的变化对小孢子转化率影响较小。

培养温度在25 ℃ (白天/晚上) 和16 h光周期。

3 单倍体遗传研究存在的不足

采用单倍体育种最大的问题是受花期限制，和外源的化学物质处理，例如秋水仙素用来将单倍体植株染色体加倍。通过单倍体育种得到双单倍体这种技术并不是适用于任何物种，在有些不适用于单倍体育种技术的育种物种中，发展和启动这种技术成本太大。

小孢子虽然使得转化后容易获得纯合的转基因材料，极大缩短育种时间等显著优点，但是小孢子自身的缺陷在于：（1）小孢子本身壁较厚，工程菌种侵染转入较为困难，所以需要更多优化措施帮助提高转化效率；（2）小孢子受限于物种不同，开花季节取得小孢子时间受限，并且小孢子对外界条件比如遗传因素、抗生素等因素敏感；（3）小孢子衍生胚属于多细胞组织，转化这些组织会产生嵌合体。所以高效率的小孢子转化还需要更多深入研究。

[1]杜志钊,陆瑞菊,黄剑华.以单倍体材料为转化受体的植物转基因研究进展[J].核农学报,2010(2):302-306.

[2]林良斌,刘雅婷,董娜,等.农杆菌介导转化甘蓝型油菜大田植株小孢子[J].云南农业大学学报,2006(05):12-17.

[3]陆瑞菊,孙月芳,王亦菲,等. Studies on Improving Response of Microspore Culture in Barley%提高大麦游离小孢子培养反应的研究[J].大麦与谷类科学,2004,000(002):14-16.

[4]于晓玲,崔百明,卫海滨,等.基因枪转化法在棉纤维细胞中瞬时表达外源基因的研究%Study on Transient Expression of Target Gene in the Epidermal Cells of Cotton Ovules via Particle Bombardment[J].棉花学报,2007,019(006):419-423.

[5]王炜,杨随庄. The Initiation of Microspore Embryogenesis in Higher Plants%高等植物小孢子胚发生的启动[J].生物技术通报,2011,000(001):14-20.

申敏（1987- ），女，山西潞城人，硕士，研究方向：食品生物技术。

S513

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2095-1205(2019)11-27-02

10.3969/j.issn.2095-1205.2019.11.14