干细胞用于生物型人工肝的研究进展

郭志辉 韩焕钦 郑伟强

肝功能衰竭是肝病终末期的临床表现之一。现如今治疗肝功能衰竭的人工肝治疗方法依然是非生物型人工肝(Non-Bioaritificial Liver, NBAL)，非生物型人工肝不具有肝细胞合成白蛋白、凝血因子等活性物质的功能，但生物型人工肝(Bioaritificial Liver, BAL)却很好地弥补了非生物型人工肝在合成、分泌方面的不足。本文主要介绍了生物型人工肝的干细胞的来源、诱导分化以及生物型人工肝的临床应用。作为肝功能衰竭的有效治疗方式，生物型人工肝必将成为今后研究和应用的热点。

肝炎病毒、药物、酒精、自身免疫性疾病等多种因素可导致急性、慢性肝衰竭，而肝衰竭后期患者病死率大于50%[1]，目前肝衰竭的治疗方法主要还是内科综合治疗、非生物型人工肝支持治疗及肝脏移植等。内科综合治疗主要以药物治疗，但未能立即缓解患者病情，而非生物型人工肝能明显有效地清除患者体内毒素及代谢废物，改善患者内环境、凝血功能，缓解黄疸、皮肤瘙痒、肝性脑病、腹水等症状体征，但由于其价格昂贵、无法降低患者病死率，所以只能用于缓解急慢性肝衰竭症状或桥接肝脏移植手术[2]。研究表明，肝脏移植手术是目前大部分急、慢性肝衰竭的唯一有效治疗手段[3]，但肝脏供体来源不足一直是限制肝脏移植手术的主要因素[4]。

近年来研究指出，生物型人工肝能够清除急、慢性肝衰竭患者体内代谢性废物，降低血清氨、胆红素的水平，以及合成肝脏的活性物质，如凝血因子、纤维蛋白原、白蛋白等[5]，并促进肝衰竭患者的肝细胞再生，弥补了非生物型人工肝的不足[5]。生物型人工肝使用的细胞来源之一就是干细胞[5-6]，本文就干细胞的来源、诱导分化、生物型人工肝的应用进行综述。

一、干细胞的来源、诱导以及分化

干细胞包括人胚胎干细胞 (Human Embryonic Stem Cells, HESCs)、诱导人多能干细胞 (Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs) 和人间充质干细胞( Human Mesenchymal Stem Cells, HMSCs) 等，人间充质干细胞又包括骨髓间充质干细胞 (Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)、造血干细胞、肝脏干细胞和脂肪干细胞(Adipose Stem Cells, ASCs)等。

HESCs来源于人类早期受精卵的内细胞团，Thomson等[7]研究指出HESCs能高水平地表达端粒酶活性，能够以未分化的细胞状态在体外无限增殖，并保持内胚层、中胚层、外胚层的各个组织的分化潜能。在人胚胎干细胞系BG01V/hOG培养基中加入生长因子及制瘤素M后可检测出白蛋白的高度表达，意味着HESCs沿肝脏谱系分化成肝细胞样细胞[8]。即使经过长时间的体外培养和冷冻保存，HESCs产生的功能性肝细胞样细胞仍保持稳定的生理活性，在四氯化碳诱导的纤维化大鼠肝脏中移植冷冻保存的HESCs衍生的肝祖细胞后有显著的治疗效果，包括改善大鼠的肝组织学和肝酶的生物化学指标以及增加大鼠的存活率，这一研究结果对临床应用HESCs衍生的肝谱系细胞有着重要的指导作用，但使用HESCs面临着伦理道德的争议[9]。

HIPSCs是从人体中的体细胞提取而来，并经过重编诱导形成的具有自我更新能力及分化成任何类型细胞的潜能。2007年前人类多能干细胞(Human Pluripotent Stem Cells, HPSCs)的唯一来源是HESCs[10]，但有研究表明，Takahashi和Yamanaka2007年研究证实可以通过整合逆转录病毒转导了四种确定的基因OCT3 / 4，SOX2，KLF4和C-MYC，并诱导重编成人面部真皮成纤维细胞产生HIPSCs[11]，通过实验表明，有可能完全从HIPCs诱导产生初期肝脏细胞组织[12]。此外，HIPSCs在形态学、增殖、表面抗原、基因表达、多能细胞特异性基因的表观遗传状态和端粒酶活性方面与HESCs相似，HIPSCs技术的出现给科学家们提供了人类胚胎样干细胞的同时也避免了许多有关使用HESCs的道德限制[10]。通过在培养基中加入表皮生长因子、血管生长因子及肝细胞生长因子，干细胞衍生的肝脏组织显示肝功能超过365 d，未来可作为临床的肝脏组织来源或体外肝脏功能支持[13]。

HMSCs存在于人类的各种组织中，具有分化成原有组织细胞或其他组织细胞的潜能，并具有再生、修复组织损伤等功能。人胎儿间充质干细胞从多种组织提取而来，包括胎儿前三个月的血液、肝脏、脂肪组织、骨髓以及胎盘、脐带、羊水中分离提取[14-18]，研究表明，在某些条件下，HMSCs可以在体外和体内分化成许多细胞类型，包括肝细胞[19]。迄今为止已经开发了四种主要方法来诱导HMSCs向肝细胞的转分化，分别为更改相应化学化合物和细胞因子，进行遗传修饰以及微环境的调整，改变培养HMSCs的物理参数从而实现间充质细胞向肝细胞的转变。HMSCs转化成肝细胞的同时HMSCs也通过旁分泌分泌营养因子，以及与细胞增殖有关的细胞因子和生长因子，从而减少肝细胞凋亡的数量，起到使肝损伤患者肝脏细胞再生，改善患者肝功能的作用[20]。

二、生物型人工肝

BAL是由生物反应器及装置内的分离培养的肝细胞或功能性肝细胞组成，在体外具有肝脏的解毒、转化、生物合成及分泌等功能。BAL目前有体外肝脏辅助装置(Extracorporeal Liver Assist Device, ELAD)系统及生物人工肝支持系统(Bioartificial Liver Support System, BLSS)等[21]。ELAD适合血流动力学及脑灌注压不稳定、凝血功能障碍、肝性脑病的患者，能有效降低血氨，改善神经系统中毒症状，在芝加哥大学的初始临床试验中，ELAD系统为多个装有100 g永生化人肝细胞的中空纤维滤筒盒及血液泵组成，治疗5例暴发性肝衰竭患者，在治疗过程中停用血管收缩药物及降低吸入氧气浓度后，血流动力学(脑灌注及平均动脉血压)稳定，治疗期间患者不需要输注任何血液制品，因此可避免血液疾病的传播，5例患者均经历了257 h的治疗，证明该ELAD能维持功能并连续长时间使用，延长所有患者生存时间并成功实施肝移植手术，但治疗人数较少，而应进行更大规模的随机试验验证该实验结果[22]。ELAD在另一项III期临床试验中使用人肝母细胞瘤细胞系HepG2/C3A(100 g)治疗96例酒精性肝功能失代偿期患者，治疗91 d后血肌酐<1.3 mg/dL，国际标准化比值(INR)≤2.5，存活率为93.9%，而对照组为68.4%[23]。

BLSS系统也是由中空纤维滤芯生物反应器及血泵组成，约70～100 g猪肝细胞被放置于生物反应器的外腔中。首次应用BLSS进行Ⅰ/Ⅱ期临床实验治疗1例41岁的非洲裔美国女性特发性暴发性肝衰竭伴肝性脑病患者，BLSS灌注期间仍能保持凝血功能，但每次开始灌注时患者出现短暂性低血压、血糖降低及血小板减少10%，灌注后期血压及血小板恢复正常，血糖降低机制尚未清楚。BLSS在第2次灌注时可迅速清除血氨、乳酸，降低血清总胆红素、ALT、AST的水平，有效提高氧合指数，改善呼吸功能，灌注期间神经精神系统未见恶化。BLSS治疗后患者血液生化指标得到明显改善,其中白蛋白含量升高，凝血酶原时间、INR明显趋向正常。BLSS适用于乳酸、血氨明显升高合并凝血功能异常的肝性脑病患者，但缺点是无法清除肌酐和尿素氮[24-25]。

三、干细胞用于BAL的临床疗效

为探讨新型BAL的免疫安全性，张悦等使用猪肝细胞-骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为反应细胞，以乳糖酰基壳聚糖纳米纤维支架的多层平板作为生物反应器用于治疗D氨基半乳糖诱导的比格犬急性肝衰竭模型，实验组接受治疗后各个脏器均未检测出免疫球蛋白IgM、IgG及补体C3的沉积，显示出该BAL具有良好的免疫安全性[26]。

由人胎儿成纤维细胞重编程诱导得到人功能性肝细胞(human induced functional hepatocytes，hiHeps)并用于hiHep-BAL系统，hiHep-BAL系统的组件包括三个滚子泵，肝素泵，血浆过滤器，血浆成分分离器和多层平板生物反应器(中空柱支架及65层圆形平板组成，均由聚碳酸酯制成)，用于治疗D-半乳糖胺诱导的急性肝功能衰竭猪模型，与对照组比较，hiHep-BAL组处理的猪在第3天检测血液生化结果提示氨和总胆红素的血清水平明显降低，凝血酶原时间、AST、ALT下降趋势明显，以及通过合成分泌人白蛋白的活性显示代谢解毒能力并显示出改善急性肝衰竭猪存活率的治疗效果，第5天肝性脑病症状得到明显缓解，在组织学、基因表达分析显示hiHep-BAL组猪的炎症细胞因子TNFα和IFNγ的表达及炎症细胞因子的mRNA水平显著下调，表明炎症反应消退及肝细胞的死亡减少，此外在第7天可检测到猪肝增殖细胞及增殖的基因，猪肝组织再生，肝功能得到改善，鉴于hiHeps在治疗急性肝功能衰竭猪中的显著疗效，可通过细胞球悬浮技术开发下一代生物反应器用于急性肝功能衰竭患者[27]。

综上所述，干细胞用于生物型人工肝治疗肝衰竭的临床疗效显著，同时具有肝脏细胞合成分泌白蛋白、分泌凝血因子、清除血氨的功能，促进肝细胞再生，但其仍处于临床实验阶段。

四、讨论与展望

研究报道[23, 27]，肝细胞样细胞可来自HPSCs，因此HPSCs衍生的肝细胞可作为BAL细胞来源，但HPSCs真正用于BAL仍需要解决以下问题： 1、生产临床使用的BAL装置至少需要450亿个HPSCs来源的肝细胞，而培养450亿HPSCs并诱导其分化为肝细胞的过程消耗大量培养基和补充物，对于大规模的临床应用来说成本过于昂贵。2、目前对HPSCs衍生的肝细胞是否可以在BAL装置中长期维持其肝功能尚未研究充分，并且需要解决在整个治疗过程中细胞活力和功能有可能丧失的问题。BAL仍处于临床实验阶段，未来进入临床造福患者仍需要进一步研究。