乙型肝炎肝硬化患者血清OPN、sHSP25表达水平及其临床意义

宋红波 杨淑娟 李燕平 贾小洲 王凤兰

慢性乙型肝炎中大概有25%～40%會演变成肝硬化，最终至肝癌。找到与疾病发病过程相关的生物标志物十分重要。骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型、黏附性的钙结合磷酸化糖蛋白，研究表明，OPN可能在乙肝肝硬化当中担任一定的作用[1]。小分子热休克蛋白25(SmallHeat Shock Proteins 25(sHSP 25))在细胞内的作用包括赋予细胞以耐热性以抵抗高温，防止蛋白聚集，抑制细胞凋亡，调节细胞生长[2]。sHSP25是上皮细胞受损后的重要修复因子，肝硬化患者胃肠道菌群失调，易诱发细菌性腹膜炎，那么在这部分患者体内，可能存在着sHSP25表达异常[3]。本研究对乙肝肝硬化患者血清OPN、sHSP25水平进行检测，结合患者的肝脏指标和基础生化指标，分析这两种蛋白与疾病病程的关系。

资料与方法

一、一般资料

本研究采用前瞻性研究模式，选取2014年2月至2016年2月来我院进行治疗的乙肝肝硬化患者作为研究对象，按照纳入标准和排除标准选择其中120例作为研究对象进行分组。将其根据Child-Pugh评分分为A、B、C三组：评分在5～6分之间的患者为A组(无肝硬化)；评分在7～9分之间的患者为B组(轻至中度肝硬化)；评分在10～15分之间的患者为C组(严重肝硬化)。选择同一时间来我院进行体检的健康人群作为对照组。其中，A组共32例患者，男17，女15，平均年龄(49.8±3.6)岁；B组共48例患者，男23，女25，平均年龄(46.7±5.4)岁；C组共40例患者，男28，女22，平均年龄(47.1±6.2)岁；对照组共40例患者，男18，女22，平均年龄(46.8±4.9)岁。

经检验，四组患者基本情况差异不具有统计学意义(P>0.05)。本研究获得了我院医学伦理委员会的批准，所有患者均对研究内容知情同意并签署了知情同意书。

二、 纳入标准和排除标准

(一)纳入标准 1、患者有慢性乙型肝炎病毒感染病史，相关标准如下：乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性或阴性，且乙型肝炎核心抗体IgM阴性；或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性，乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性或阴性，且肝组织活检结果显示感染慢性乙肝，在有肝组织活检结果的情况下，以肝组织活检结果为准；2、未接受过任何抗病毒治疗者；或既往接受过干扰素或聚乙二醇干扰素治疗，或接受过抗HBV核苷类药物(拉米夫定、替比夫定、恩替卡韦、阿德福韦酯或替诺福韦酯)治疗者，终止治疗时间距离筛选≥3个月；3、既往6个月未接受过中药、免疫调节剂、胸腺肽或其他免疫刺激因子等抗病毒治疗者；

(二)排除标准 1、有药物滥用史或尿检阳性(阿片类、巴比妥类、苯二氮卓类、三环抗抑郁药、苯环己哌啶、安非他命、大麻、可卡因)者；2、过敏体质者(多种药物及食物过敏)，包括已知对核苷或核苷类似物过敏；3、试验前3个月内参加了任何临床试验(如果受试者在治疗前退出研究，即未被随机化或未接受治疗，可以入组本研究)。

三、实验方法

(一)样本采集和分析 所有患者均禁食12 h后取静脉血，离心，收集血清用于各项生理生化指标测定。本研究采用山东省西奈电子设备有限公司生产的B360全自动血液分析仪对实验样本进行检测，测定所有血液样本的总胆红素(Total bilirubin, TBil)、清蛋白(Albumin, Alb)和凝血酶原时间(Prothrombin time, PT)，采用改良鳖试验法测定血内毒素水平。采用酶联免疫吸附法测定血清OPN和sHSP25水平，酶联免疫试剂盒购自深圳新产业生物科技有限公司，所有操作步骤均按照说明书所标明标准操作步骤来进行。

同时对患者的四项肝纤维化指标也进行检测，包括透明质酸酶(Hyaluronidase，HA)，层黏连蛋白(Laminin，LN)，Ⅲ型前胶原氨基端肽(Type III procollagen amino terminal peptide，PIIINP)和Ⅳ型胶原(Type Ⅳ collagen, CIV)。检测方法为放射免疫法。

结 果

一、临床生化指标对比

四组受试者临床生化指标：TB在对照组、A组、B组和C组患者体内的水平分别为13.26±2.16，28.43±9.24，48.24±10.25，148.3±14.16(μmol/L)；Alb：37.46±4.47，36.21±2.24，29.02±1.73，26.08±1.19(g/L)；PT: 13.87±2.75,14.75±3.19,17.78±2.83,21.89±0.90(s)；内毒素：0.05±0.01，0.07±0.02，0.13±0.06，0.34±0.11(Eu/mL)。对照组受试体内TB水平显著低于其余三组(P<0.05)，而随着乙肝患者Child-Pugh评分增加，其体内TB水平明显增加(P>0.05)。A组患者的对照组受试者Alb、PT和内毒素水平没有显著差异，但是与B组和C组患者Alb、PT和内毒素水平有显著差异。对照组和A组Alb水平显著高于B组和C组患者(P<0.05)，而PT显著短于B组和C组患者(P<0.05)，内毒素水平显著低于B组和C组患者(P<0.05)。

二、肝纤维化指标对比

四组受试者肝纤维化指标结果：HA在对照组、A组、B组和C组患者体内的水平分别为：60.79±10.13，62.26±8.02，150.43±30.06，424.06±46.93(ng/mL)；LN：71.46±7.17，72.38±8.53，171.94±24.14，325±65.34(ng/mL)；PIIINP：64.27±11.04，66.04±9.01，190.12±30.03，246.45±45.70 (ng/mL)；CIV：52.41±6.15；51.87±8.09，100.26±15.17，180.68±30.13 (ng/mL)。对照组受试者和A组患者之间的四项肝纤维化指标没有显著差异(P>0.05)，但B组和C组患者四项肝纤维化指标水平显著大于A组和对照组(P<0.05)，且C组患者四项肝纤维化水平最高(P<0.05)。

三、血清OPN和sHSP25水平

四组受试者血清OPN和sHSP25水平结果：OPN在对照组、A组、B组和C组患者体内的水平分别为：25.42±4.52，55.27±12.63，85.42±21.63，138.85±29.7(ng/mL)，sHSP25：89.43±12.45，109.94±15.56，183.09±25.54，207.06±32.49 (μg/L)。A、B、C三组患者OPN和sHSP25水平显著高于对照组受试者，且随着Child-Pugh评分的增高，乙肝患者体内OPN和sHSP25水平逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)。

讨 论

从动态的观点来看，肝硬化是肝纤维化的晚期和极端严重化的状态[4]。肝纤维化和肝硬化的发生、发展和转归取决于二者的“净效应”。OPN是细胞外基质中的一种非胶原糖蛋白，它可以通过一些生理途径调节和影响细胞外基质的沉积。有研究表示[5]，OPN与其下游受体相结合后具有激活和促进肝星状细胞增殖的生理作用。而肝星状细胞则可以直接参与到细胞外基质的合成当中。在本研究中，我们发现，随着患者Child-Pugh评分的增加，肝纤维化指标的增大，乙肝患者体内的OPN水平也呈现出显著升高的趋势。由此说明，OPN在乙肝患者肝纤维化和肝硬化的过程中起到重要作用，通过对OPN的检测，可以辅助临床对于乙肝患者肝脏生理功能的判断。

除了高温以外，其他一些刺激因素如氧自由基、缺氧、病毒入侵、细菌感染等，也会造成细胞分泌HSP[6]。乙肝肝硬化患者往往存在胃肠道菌群过度生长并通过小肠上皮细胞侵入体液，造成患者血液感染的例子[7]。在本研究，我们也对患者体内内毒素水平进行了监测，结果发现随着患者肝硬化程度的增加，其血液中内毒素水平也在逐步增加。受到胃肠道过度繁殖的菌群的刺激，乙肝肝硬化患者体内sHSP25的表达也显著增加。胃肠道菌群繁殖时产生的锻炼脂肪酸、脂多糖等可以刺激肠道上皮细胞生成sHSP25，是促使sHSP25分泌的生物物质基础[8]。胃肠道上皮细胞过度分泌sHSP25是一种生理保护的反应，sHSP25具有修复胃肠道降低胃肠道通透性的生理作用。

综上所述，乙肝肝纤维化患者血清OPN和sHSP25水平可以反应患者肝硬化程度，两者水平越高的患者肝功能越差。