猪精液4 低温保存技术研究

崔茂盛，刘 鑫,，张 丹，唐佩娟，穆淑琴，张学炜，李千军*

（1.天津市畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300380；3.天津市动物疾病预防控制中心，天津 300402；4.天津市畜牧总站，天津 300402）

精液保存技术可以延长精子贮存时间并维持受精能力，扩大精液使用范围，提升种公畜利用价值。与冷冻精液相比，液态保存精液人工授精后具有受胎率高、窝产仔数高、费用低、操作程序简单等优点[1]。研究指出，猪精液低温保存过程中精子代谢活动降低、能量利用减少，有利于延长精子的存活时间[2]。如果4 保存技术能进一步扩大猪精液利用效率，便可提高养猪场经济效益[3]，而且4 冰箱条件比17 恒温箱条件更易获得。然而，由于物种差异性，猪精子的低温耐受力较差、温差变化敏感。低温保存过程中质膜易受到损伤，产生一系列不利影响，妨碍了猪精液4 保存技术在生产中的应用推广[4]。因此，本实验筛选开发4 猪精液保存稀释剂，旨在为今后猪精液生产应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 精液来源 本实验所用精液采自天津市天泰星火猪人工授精服务中心3头健康、年龄在2～4岁的大白种公猪，采用常规手握法采精，收集富含精液部分，滤纸过滤于保温瓶中，采精室备用，控制原精活率0.8以上，可进行后续实验。

1.2 试剂与仪器 主要试剂：果糖、大豆卵磷脂（上海源叶生物科技有限公司），葡萄糖（天津市光复精细化工研究所），青霉素、链霉素（山东鲁抗舍里乐药品有限公司），碳酸氢钠、EDTA等（Sigma中国有限公司）。主要仪器设备：CASA计算机自动辅助分析系统（福州鸿视野软件技术有限公司）、相差显微镜（蔡司ZEISS）、冰箱（河南新飞电器有限公司）、电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）、精子快速染液（南京建成生物科技有限公司）。

1.3 低温稀释液的配制 在徐振军等[4]的实验配方基础上，低温I号添加0.02 g果糖、0.125 g碳酸氢钠、0.075 g大豆卵磷脂；低温Ⅱ号添加0.05 g果糖、0.125 g碳酸氢钠、0.037 5 g大豆卵磷脂、0.125 g EDTA；对照组为市场占有率高、性能稳定、能耐受4 低温的某品牌长效稀释剂。

1.4 精液稀释与平衡 稀释：原精取回采精室，遮光放置，测量原精和稀释剂温度，温差控制1 以内。将稀释剂（低温I号、低温Ⅱ号，对照组）按3:1的比例缓慢倒入原精中，稀释期间轻轻摇晃均匀。

平衡：室温条件下，稀释精液分装到已灭菌的80 mL精液瓶中，遮光放置0.5 h；之后用4层毛巾包裹放入泡沫箱中，置于l7 恒温箱降温2.5 h以上，然后泡沫箱移入4 冰箱中保存，每隔24 h取样检测1次。

1.5 实验设计 实验分为2部分：第1部分实验分3组，将采集的大白种猪精液平均分成3份，以成品稀释剂为对照组，设置低温I号和低温Ⅱ号2个实验组，每隔24 h检测1次精子活力、质膜完整性和精液pH，重复3次；第2部分实验分9组，采集大白、长白和杜洛克种猪精液分别设置对照组和低温I号、低温Ⅱ号实验组，每隔24 h检测1次精子活力，记录保存时间，重复3次。

1.6 精子质量检测 精子质量检测指标为活力、质膜完整性[4]、pH和精子存活时间。精子存活时间包括总存活时间和有效保存时间，总存活时间为精子全部死亡时的保存时间，有效存活时间为精子活力保持0.6以上时的保存时间。活力、质膜完整性及pH检测方法参考文献[4]。

1.7 统计分析 各组数据用Excel进行前期处理，用SPSS17.0软件进行One-Way ANOVA方差分析，并进行多重比较，结果用平均值±标准差表示，检测误差为5%和1%。

2 结果分析

2.1 大白猪精子在4 保存过程中的活力变化 由表1可知，在精液4 保存的前2 d，各组精子活力差异不显著（P＞0.05）。而保存至第6天，低温I号和低温Ⅱ号的精子活力显著高于对照组（P＜0.05）。本实验中，低温I号和低温Ⅱ号均能有效保存精子10 d以上。

2.2 大白猪精液4 保存过程中pH的变化 由表2可知，低温I号和低温Ⅱ号组猪精液4 保存过程中pH具有较强的稳定性，实验第1天3组精子稀释液的pH差异不显著（P＞0.05），第7天和第10天时对照组pH显著低于2个实验组（P＜0.05），保存到第14天时低低温I号和低温Ⅱ号组的pH差异显著（P＜0.05）（对照组第10天精子已抛弃，所以无第14天检测结果）。

表1 不同保存剂对精液保存精子活力的影响 %

表2 不同保存剂对精液pH的影响

2.3 大白猪精液4 保存过程中精子的质膜完整性 由表3可知，保存第5天、第10天，实验组中精子质膜完整性均显著高于对照组（P＜0.05）。

表3 不同保存剂对精子质膜完整性的影响 %

2.4 不同品种猪精子在4 保存过程中的有效保存和总存活时间 由表4可知，无论大白、长白还是杜洛克种猪，低温I号和低温Ⅱ号组精液有效保存时间和总存活时间均显著高于对照组（P＜0.05）；其中，在长白种猪精液的有效保存时间以及杜洛克、大白种猪精液的总存活时间上，低温I号显著高于低温Ⅱ号（P＜0.05）。

3 讨 论

本实验表明，在4 低温保存过程中，不同稀释剂对精子保护效果差异较大，而且不同品种的保存效果存在较大差异。这与之前研究报道中不同公猪本身精液质量具有较大差异的结论较为一致[5]。在本实验中，课题组研发的低温I号、Ⅱ号猪精液低温保存剂对猪精子具有较强的保护作用，无论在有效保存时间、总保存时间，还是在精子质膜完整率等指标上均显著优于对照组，这可能与稀释剂中添加大豆卵磷脂有关，研究表明，大豆卵磷脂有较好的低温抗性对质膜有一定保护作用[6]。在猪精液4 保存过程中，大多研究者采用卵黄作为低温保护剂，但卵黄制作过程复杂而且容易引入病菌[7]。本实验添加的大豆卵磷脂为植物性成分，能有效降低细菌病毒的污染，且具有较好的质膜保护作用。此外，本实验还表明，低温I号和Ⅱ号在精子4 保存过程中pH变化较缓慢且均匀，能有效避免精子在长时间保存过程中由于酸中毒而死亡，这也可能是实验组具有较好精子4 保护能力的原因之一。

表4 不同保存剂对不同品种猪精子保存时间的影响