非小细胞肺癌化疗敏感性与EML4-ALK、EGFR、KRAS、c-MET基因状态的关系

黄晖，李丽华，万敏娜，万琳，邹怀宇，万洁华

（宜春市人民医院 全科医学科，江西 宜春 336000）

肺癌是中国最常见的恶性肿瘤之一[1]，我国女性非吸烟患者中以腺癌为主，吸烟患者则多见鳞状细胞癌。化疗使得中晚期非小细胞肺癌患者受益，能延长患者的疾病无进展时间和总生存时间。近年培美曲塞单药或联合铂类成为肺腺癌的一线治疗；紫杉醇类或吉西他滨联合铂类用于肺鳞癌的一线治疗。但有效率不容乐观，化疗的总有效率不足35%。如何预判患者的化疗反应成为临床研究的热点。基因检测揭示癌细胞的基因特点。最早引起关注的是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变，该突变使得癌细胞加速增殖、分化和侵袭，而该基因改变在亚洲非吸烟女性的肺腺癌患者中更易被发现[2]。针对突变患者，使用EGFR-酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）治疗，较传统治疗比较，患者的无病生存期和总生存期均延长[3-5]。随着研究的进展，人们发现EGFR-TKI的耐药基因和新的靶点，比如间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）基因突变预示着EGFR-TKI治疗效果差[6]，KRAS基因（K-ras,p21）和c-MET靶点有潜在的治疗价值等[7-8]。但是靶向治疗虽然在晚期肿瘤患者中研究众多，且多数研究结果显示患者受益，靶向治疗如何与传统治疗包括化疗、放疗等治疗方法协同，靶点基因改变是否与传统治疗效果存在相关性等问题仍未明确。循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA,ctDNA）主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在。ctDNA来自肿瘤细胞基因组突变，检测准确性高、很少出现假阳性。ctDNA是一种特征性的肿瘤生物标志物，来自肿瘤细胞的体细胞突变[9-12]，不同于遗传突变的是其存在于体内每个细胞。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月—2018年1月在江西省宜春市人民医院就诊的肺癌患者，经活检证实为非小细胞肺癌，参照CT、MRI、B超等检查结果明确局部淋巴结转移情况，参照第8版肺癌TNM分期，入组Ⅲ期b至Ⅳ期患者96例。患者接受化疗至少2个周期后评判治疗效果，化疗方案为：腺癌采用培美曲塞+顺铂；鳞状细胞癌采用紫杉醇+顺铂。参照实体瘤的疗效评价标准（RECIST 1.1）[13]，将效果分为：①完全缓解，指靶病灶消失，病理淋巴结直径小于1 mm，持续＞4周；②部分缓解，指病灶直径之和减少超过30%，持续＞4周；③疾病进展，指病灶直径之和超过20%；④疾病稳定，指未达到部分缓解，也未达到疾病进展的程度。参照WHO化疗毒副作用分级，将化疗副作用分成5级[14]。参照Karnofsky功能状态评分标准（KPS评分）评价患者体力状况。

本实验患者平均（64.25±12.46）岁；男∶女为15∶33；患者有吸烟史22例；腺癌64例，鳞状细胞癌32例；Ⅲb期患者42例，Ⅲc期患者38例，Ⅳ期患者16例；治疗前Karnofsky评分均小于60分患者。

1.2 研究方法

1.2.1 收集样本 血液标本均在患者接受治疗前保留。本研究经本院伦理委员会审批同意，所有患者在保留血液标本和检测ctDNA前均签署知情同意书。

1.2.2 血清收集、ctDNA 扩增和基因突变分析 患者于治疗开始前1天清晨收集10 ml静脉血，置于含有 EDTA 的标本管内，于收集2 h内4℃，3 000 r/min离心10 min；血浆在监测分析前置入-80℃冰箱冷冻保存。采用扩增受阻突变系统（amplification refractory mutation system,ARMS）血浆EGFR、ALK、KRAS、c-MET基因突变分析方法，对外周血测ctDNA中目标基因状况进行检测。外周血肿瘤细胞游离DNA的提取方法按照厦门艾德生物医药科技有限公司血浆标本DNA提取试剂盒说明书进行操作。ARMS实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）扩增采用厦门艾德生物医药科技有限公司目的基因检测试剂盒，按照试剂和操作步骤和要求对目的基因突变状态进行监测分析。

1.2.3 化疗方案 腺癌患者 64 例均接受培美曲塞（500 mg/m2，第 1 天）+ 顺铂（75 mg/m2，第 1 天）化疗方案化疗，16例患者接受化疗2周期后手术，48例患者接受4周期化疗后接受评价；鳞状细胞癌患者32例均接受紫杉醇（175～200 mg/m2，第1天）+顺铂（75 mg/m2，第1天）方案化疗，6例患者接受2周期化疗后手术，10例患者接受3周期化疗后手术或更改治疗方案，16例患者接受4周期化疗后评价。其中接受手术在手术结束1周后进行评估。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计数资料以例（%）表示，比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义

2 结果

2.1 血清基因变化、化疗效果及化疗副作用情况

EGFR基因突变包括EGFR酪氨酸激酶编码区18、19、20、21外显子的突变为点，共检测50例突变患者，检测率为52.08%。其中18外显子突变者8例，19外显子缺失突变者24例，21外显子突变者26例；其中6例合并有19外显子缺失突变，2例合并18外显子突变。AML4-ALK基因融合突变者4例，检测率为4.17%。KRAS基因突变者8例，检出率为8.33%。c-MET基因突变者16例，检测率为16.67%。本试验化疗总有效率为29.17%（28例/96例），其中腺癌患者总有效率为31.25（20例/64例）；鳞状细胞癌患者总有效率为25.00%（8例/32例）。消化道副作用包括恶心、呕吐、腹泻、便秘等48例，严重消化道反应需补液治疗者10例；骨髓抑制60例，严重骨髓抑制、需集落刺激因子注射治疗的8例；不同程度脱发者30例，严重者4例；其他未见明显毒副反应。见表1。

表1 患者的化疗效果情况

2.2 不同EGFR基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况

50例EGFR突变患者中包括48例肺腺癌患者和2例肺鳞癌患者，化疗有效12例，有效率为24.00%；46例EGFR野生型患者中包括16例肺腺癌患者和30例肺鳞癌患者，化疗有效21例，有效率为45.65%。两组化疗有效率差异有统计学意义（P＜0.05）。两组化疗严重化疗毒副作用的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.3 不同ALK基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况

5例ALK突变者中有4例为棘皮动物微管相关蛋白样4与间变淋巴瘤激酶融合基因（echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）融合突变患者，他们均为肺腺癌患者，这4例化疗均有效，有效率100%；92例无AML4-ALK融合突变患者中包括60例肺腺癌患者和32例肺鳞癌患者，化疗有效28例，有效率30.77%。两组化疗有效率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。两组化疗严重化疗毒副作用的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.4 不同KRAS基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况

8例KRAS突变患者均为肺腺癌患者，化疗总有效例数为6例，有效率75%（6例/8例）；88例KRAS无突变患者中包括56例肺腺癌患者和32例肺鳞癌患者，化疗总有效例数为27例，有效率30.68%。两组化疗有效率差异有统计学意义（P＜0.05）。两组化疗严重化疗毒副作用的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表4。

表2 不同EGFR基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况 例（%）

表3 不同ALK基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况 例（%）

2.5 不同c-MET基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况

16例c-MET突变患者中包括14例肺腺癌患者和2例肺鳞癌患者，化疗有效为2例，有效率12.50%（2/16）；80例c-MET无突变患者中包括50例肺腺癌患者和30例肺鳞癌患者，化疗有效为31例，有效率38.75%。两组化疗有效率差异有统计学意义（P＜0.05）。两组化疗严重化疗毒副作用的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

表4 不同KRAS基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况 例（%）

表5 不同c-MET基因状态患者的化疗效果及化疗副作用情况 例（%）

3 讨论

最新的统计数据显示，我国每年有约28万例新确诊的肺癌患者，其中很大部分为晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）[1]。针对晚期NSCLC治疗手段多选择含铂类药物的化疗，但化疗只有约20%的反应率和8～10个月的中位生存期。虽然研究众多，但是如何在治疗之前判断化疗受益的患者仍然是个难题。

分子遗传学研究进展让人们认识并尝试识别导致NSCLC的关键基因突变，也因此诞生了各种特异性的分子靶向药物。肺癌的组织亚型不同，治疗的方法也不同。非鳞状NSCLC患者使用培美曲塞+铂类效果优于吉西他滨+铂类。以肺腺癌为例，可以根据相关驱动基因突变进一步细分成亚群。常见的肺腺癌驱动基因包括EGFR、KRAS、人类表皮生长因子受体 2（human epidermal growth factor receptor-2,HER2）及MET基因突变和ALK等基因重排。驱动基因的表达存在组织学差异，相比腺癌，鳞状细胞癌中，EGFR基因突变非常罕见，多见成纤维细胞生长因子受体1的基因扩增，盘状结构域受体2基因突变和PI3KCA基因的扩增和突变。

在NSCLC的研究中，EGFR一直是一个热点。回顾性研究显示[15]，亚裔女性的腺癌患者、既往少量/无吸烟史，EFGR突变率可达60%，使用EGFR TKI治疗的敏感率也高。18～21号外显子突变可编码出大量EGFR酪氨酸激酶，对初发的敏感性EGFR突变的NSCLC患者，应用TKI治疗在客观反应率（objective response rate,ORR）、无进展生存期（progression-free survival,PFS）和生活质量均优于化疗。因此，晚期NSCLC患者常规进行EGFR基因检测，可根据突变情况选择是否行EGFR TKI一线治疗。但随着临床观察的积累，人们发现，所有接受TKI治疗的患者最终会出现耐药，并导致肿瘤进展和死亡[16]。靶向治疗的进展开始围绕着解决耐药和寻找新的靶点展开。

EML4与ALK是分别位于人类2号染色体的p21和p23上的基因片段[6]。EML4与ALK是新发现的肺腺癌驱动基因。这2个基因片段的倒位融合能够使得组织表达新的融合蛋白EML4与ALK，这种融合基因能通过PI3K-AKT，丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase,MAPK）和 JAK-STAT 途径导致肿瘤的发生。这种突变仅占非小细胞肺癌的4%～7%。它更容易出现在既往少量/无吸烟史和年轻的腺癌患者身上。ALK抑制剂在临床Ⅲ期研究中[17]，与化疗比较，对晚期NSCLC患者更受益，其可达56%。

MET是一种络氨酸激酶受体，它的过度激活与肿瘤发生、发展、预后与转归密切相关[7]。大约7%的NSCLC患者可出现MET的过表达。在一项克唑替尼治疗晚期非小细胞肺癌的研究表明，克唑替尼治疗MET高度过表达的患者，反应率可高达67%[18]。

KRAS是RAS家族的一员。KRAS基因突变能持续刺激细胞生长，阻止细胞死亡，从而导致肿瘤的发生。伴有KRAS基因突变的NSCLC患者会有更高的复发和转移概率。研究显示KRAS突变的概率在NSCLC患者为15%～25%，腺癌、吸烟史及白色人种是KRAS突变的危险因素[8]。虽然目前并未治疗KRAS基因突变的晚期非小细胞肺癌药物，但是人们研究重点集中在KRAS的下游通路上，如MEK。在一项临床研究中，口服的MEK抑制剂司美替尼（selumetinib）联合化疗用于经治的KRAS突变非小细胞肺癌患者。与单纯化疗比较，其（37%∶0%）、PFS（5.3个月∶2.1个月）、OS（9.4个月∶5.2个月）均有长足的进步[19]。

化疗可以干扰肿瘤驱动基因的表达状态，因此，在治疗过程中，应用靶向治疗与化疗的先后顺序如何确定成需要迫切解决的问题，以便使患者受益最大化。本研究显示，EGFR野生型患者化疗的反应性好于EGFR突变患者，肿瘤缩小的患者比例较多，虽然有许多报道显示化疗反应率在两组患者无差异，但患者的疾病无进展生存差异明显，说明EGFR突变与否影响化疗反应。笔者的数据进一步印证该现象，而笔者分析两组患者中出现严重化疗毒副作用的差异，统计显示，两组间为体现有差异，说明EGFR基因状态未影响机体对化疗的耐受能力。

从数据显示，EML4-ALK、KRAS、MET等基因的状态均影响患者的化疗效果。研究显示，KRAS的血清水平与胰腺癌的预后呈负相关[20]，其机制和KRAS影响化疗反应相关，该结果似乎与笔者的数据不符，其原因可能是以KRAS基因状态为因素分组的例数过少导致结果出现的偏差，KRAS基因状态能否影响NSCLC的化疗反应有待进一步研究。同样的情况在本研究中也出现EML4-ALK组和MET组。

有意思的是，EML4-ALK、KRAS、MET等基因状态不同，其出现严重的化疗副作用的概率也不同，虽然因为例数过少可能导致数据偏移，但这仍需引起关注。分析NSCLC患者的血清基因状态与化疗反应的关系，有利于发现化疗受益的优势人群，以便患者最大受益。