培育年限对刺五加主要药用活性成分的影响

徐明远 王谦博 郭盛磊,4 王莹威 李凤霞 刘 佳 唐中华 王振月*

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040； 2.广东药科大学附属第一医院药学部，广州 510000； 3.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 4.黑龙江珍宝岛药业股份有限公司博士后科研工作站，哈尔滨 150040)

刺五加(Acanthopanaxsenticosus(Rupr.Maxim.) Harms)为五加科(Araliaceae)五加属(Acanthopanax)多年生落叶无性系灌木，主要分布于中国东北部、朝鲜、日本、俄罗斯及西伯利亚一带，又名西伯利亚参、五加参、刺拐棒、一百针、老虎潦等。《中华人民共和国药典》(2015版)规定其干燥根及根茎或茎可入药，具有健脾、安神、补肾、祛风湿等功效[1]。现代药理学实验证明刺五加具有保护神经元和心脑血管、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、降血糖及免疫调节作用等多种功效[2]。刺五加自然更新周期约十年以上，随着刺五加片、刺五加饮料等以刺五加为原料的产品远销国内外，其天然资源面临濒危、枯竭，1992年《中国植物红皮书》中将其列为渐危物种，需大力发展人工栽培。

近年来，药用植物生长年限对其次生代谢产物的影响备受学者重视。李心怡、殷少文等对不同培育年限对川桔梗、青钱柳等药用植物活性成分影响研究结果表明，药用植物在不同生长年限次生代谢产物含量变化差异较大[3～4]。为此，可根据临床用药和中药制剂需求有选择性地确定采收年限，对中药材合理开发利用具有重要的意义。

刺五加中含有丰富的化学成分，主要包括黄酮类、简单苯丙素类、有机酸类、香豆素类、三萜皂苷类、氨基酸类以及其他类化合物[2]。目前，对于刺五加活性成分的研究主要集中在苯丙素类成分，包括紫丁香苷、异嗪皮啶以及刺五加苷E[5～7]，它们是刺五加抗疲劳、调节免疫的药效物质基础[8]。其中，紫丁香苷是中国药典中规定的质控指标成分[1]。刺五加中也具有调节免疫、抗病毒、清除自由基等多方面的药理作用的黄酮类化合物，包括槲皮苷、芦丁、金丝桃苷[9～10]。目前，对于不同培育年限对刺五加次生代谢产物影响的报道不多，王振月、张萍等对不同生长年限刺五加中异嗪皮啶含量，王振月等对不同生长年限刺五加中总黄酮含量进行了研究，研究结果表明，不同生长年限刺五加中异嗪皮啶、总黄酮含量显示出显著的差异[11～12]。由于还没有关于对苯丙素、黄酮类次生代谢产物的综合研究，故单一成分不能全面反映年限对于刺五加次生代谢产物积累的影响。

因此，本研究收集同一产地不同生长阶段刺五加，观察根部及茎部主要药用次生代谢物含量变化，以期揭示不同培育年限对刺五加苷E、槲皮苷、芦丁、异嗪皮啶、紫丁香苷、金丝桃苷6种主要药用活性成分的影响，对确定人工栽培刺五加采收年限及实际生产具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

API3000高效液相—质谱联用仪(配有电喷雾电离源(ESI)及Analyst1.4数据处理系统)美国AB公司；FZ-06中药粉碎机浙江温岭市百乐粉碎设备厂；250DC型数控超声波清洗器江苏昆山超声仪器有限公司；BS124S电子天平德国Sartorius公司；Millipore超纯水仪法国Millipore公司。

三年生、五年生、九年生种植刺五加根、茎采于黑龙江省七台河市，实验前用粉碎机粉碎，粉末过20目筛备用；刺五加苷E、槲皮苷、芦丁、异嗪皮啶、紫丁香苷、金丝桃苷(纯度均≥98%)标准品购于中国药品生物制品检定所；色谱甲醇、乙腈购于北京百灵威公司；色谱甲酸购于美国Sigma公司；去离子水用超纯水仪自制。

1.2 实验方法

1.2.1 供试样品溶液的制备

取刺五加粉末0.5 g，加入甲醇20 mL超声提取(100 kHz，40℃)30 min，过滤后将残渣再加入20 mL溶剂超声提取30 min，过滤后合并两次滤液，测定前用0.45 μm的微孔滤膜过滤。

1.2.2 标准样品溶液的制备

分别称取适量标准品用色谱甲醇溶解、定容，配制成1 mg·mL-1的标准品溶液，于4℃冰箱中保存备用，使用前根据需要用流动相配成标准工作液。

1.2.3 色谱条件

采用超高效液相色谱系统(Ultra-Performance LC，Waters，Japan)；Agilent Eclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：25℃；进样量为10 μL；流动相为水和甲醇，流速保持在0.5 mL·min-1。梯度洗脱程序为：最初0～1.5 min 25%甲醇，1.5～2 min 25%～50%甲醇，2～4 min 50%甲醇，4～4.5 min 50%～90%甲醇，4.5～5.5 min 90%甲醇，5.5～6 min 90%～25%甲醇，6～7 min 25%甲醇。

1.2.4 质谱条件

采用电喷雾离子源(Electrospray ionization，ESI)，负离子扫描、多离子反应监测(Multiple reaction monitoring，MRM)扫描方式.优化后最终的质谱条件：电喷雾离子源喷雾电压为5500V，离子源雾化温度为500℃，雾化气压为25psi，气帘气压为20psi。紫丁香苷：m/z394.8→231.8，去簇电压70 V，碰撞电压40 V，碰撞室射出电压17 V；刺五加苷E：m/z765.3.0→603.1，去簇电压70 V，碰撞电压62 V，碰撞室射出电压23 V;异嗪皮啶：m/z223.1→206.3，去簇电压60 V，碰撞电压40 V，碰撞室射出电压9 V；芦丁：m/z611.1→464.8，去簇电压80 V，碰撞电压20 V，碰撞室射出电压13 V；槲皮苷：m/z449.2→303，去簇电压50 V，碰撞电压16 V，碰撞室射出电压17 V；金丝桃苷：m/z487→324，去簇电压70 V，碰撞电压43 V，碰撞室射出电压17 V。

1.3 数据处理与分析

实验设置3个平行，数据测定均重复3次，利用SPSS 21.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)软件进行主成分分析，计算主成分的综合得分Q值，用Q值反映培育年限对刺五加主要6种活性成分的综合影响。培育年限影响的差异采用SPSS单因素方差分析，并进行t检验，当P<0.05时认为具有统计学意义。

Q值的计算公式如下：

F1=α11X1+α12X2+α13X3

(1)

F2=α22X1+α22X2+α23X3

(2)

Fp=αp1X1+αp2X2+αp3X3

(3)

Q=(λ1F1+λ2F2+…+λpFp)/(λ1+λ2+…+λp)

(4)

式中，Fp(p=1,2,…,3)为主成分得分；αp1，αp2，…，αp3为主成分表达矩阵系数(Component score coefficient)，其被计算为主成分加载向量(在分量矩阵中)除以对应特征值的平方根(在所解释的总方差中)；X是通过标准化的原始变量的值；λ是初始特征值方差的比例。

2 结果与分析

2.1 不同培育年限对刺五加6种活性成分的综合影响

通过SPSS软件进行主成分分析，用主成分综合得分(Q值)说明不同培育年限刺五加根及茎中6种主要药用次生代谢物含量变化(图1)。6种次生代谢产物的累积在根和茎中均显示出五年生最高，在根中，九年生的积累大于三年生，在茎中则显示出三年生大于九年生。

图1 不同培育年限对刺五加根、茎中次生代谢物累积的影响Fig.1 Effects of different growth years on the accumulation of secondary metabolites in roots and stems of A.senticosus

2.2 3种苯丙素类活性成分在不同培育年限的积累

由图2，紫丁香苷的含量在刺五加根中随年限增加而上升，九年生根的含量显著大于其他年限(P<0.05)。紫丁香苷的含量在刺五加茎中随年限增加显示出先上升后下降，其含量在五年生茎中显著大于其他年限(P<0.05)，三年生显著大于九年生(P<0.05)。紫丁香苷在三年生刺五加根、茎中含量无显著性差异，五年生茎中含量显著高于五年生根，九年生根中含量显著高于九年生茎。

图2 不同生长阶段苯丙素类成分在刺五加根及茎中的累积情况 A.根；B.茎Fig.2 Accumulation of phenylalanine in roots and stems of A.senticosus at different growth stages A.Root；B.Stem

图3 不同生长阶段黄酮类成分在刺五加根及茎中的累积情况 A.根；B.茎Fig.3 Accumulation of flavonoids in roots and stems of A.senticosus at different growth stages A.Root；B.Stem

刺五加苷E的含量在刺五加根中随年限的增加，显示出先上升后下降，五年生大于三年生和九年生(P<0.05)。刺五加苷E的含量在刺五加茎中随年限增加而下降，三年生大于五年生和九年生(P<0.05)。不同年限根和茎的含量比较可以看出，三年生茎含量显著高于三年生根，五年生和九年生根和茎中刺五加苷E含量无显著性差异。

刺五加根和茎中异嗪皮啶含量的变化存在相同的趋势，二者都在三年生含量最高，五年生含量最低。其中，在根中三年生和九年生含量无显著性差异，均高于五年生。异嗪皮啶在三年生刺五加茎中含量显著高于五年生和九年生(P<0.05)，九年生大于五年生，二者无显著性差异。异嗪皮啶在不同部位中的累积结果显示，三年生和九年生茎的含量显著大于根，五年生根和茎含量无显著性差异。

2.3 3种黄酮类活性成分在不同培育年限的积累

由图3可知，刺五加根和茎中芦丁的含量随着年限的增加而显示出先上升后下降的趋势，其中五年生芦丁含量显著高于三年生和九年生(P<0.05)。五年生刺五加根中芦丁含量大于三年生，五年生刺五加茎中芦丁的含量大于九年生。在不同部位中的积累，三年生根和茎无显著性差异，五年生茎显著大于根，九年生根显著大于九年生茎。各培育年限茎中芦丁的含量均显著高于根。

槲皮苷在刺五加根的含量随着培育年限的增加而降低，三年生含量显著高于五年生和九年生(P<0.05)。在刺五加茎中，槲皮苷含量随着培育年限的增加表现出先上升后下降的趋势，其含量在五年生茎中显著高于三年生和九年生(P<0.05)，且九年生含量大于三年生。槲皮苷在三年生根和茎中含量无显著性差异，五年生及九年生的茎中含量显著高于根。

金丝桃苷的含量在刺五加根中随培育年限增加显示出先上升后下降，其含量在五年生根中显著高于其他年限(P<0.05)，且九年生含量大于三年生。在刺五加茎中，金丝桃苷的含量随培育年限升高而降低，三年生茎中含量显著高于其他年限(P<0.05)。各培育年限茎中金丝桃苷的含量均显著高于根。

3 讨论

3.1 苯丙素类成分在不同培育年限的积累及其最佳采收年限

苯丙素类成分是刺五加中的主要活性成分，该类成分是刺五加的主要药效物质基础[13]。紫丁香苷是刺五加中的主要药用成分之一，有保护心血管[2]、抗肿瘤[14]及保护肾脏[15]等功效。本研究结果显示，紫丁香苷在五年生茎中累积含量最高，其次为九年生根，考虑到种植成本，获得紫丁香苷的最佳采收年限为五年。刺五加苷E具有治疗糖尿病[16]、镇静催眠[17]、促进学习和记忆[18]、抗炎性反应[19]等药理活性，是刺五加的重要药用活性成分。本研究结果显示，刺五加苷E在三年生茎中含量最高，其次为五年生根，考虑到三年生根和五年生根刺五加苷E含量并无显著性差异，收获刺五加苷E可考虑在三年采收。异嗪皮啶具有抗肿瘤[20～21]、抗炎及抗感染[22～23]等药理活性。本研究结果显示，异嗪皮啶在三年生根和茎中累积含量最高，故可考虑在三年采收根和茎，以获得最高含量的异嗪皮啶。

3.2 黄酮类成分在不同培育年限的积累及其最佳采收年限

黄酮类成分也是刺五加中具有药理活性的一类成分，同样可发挥许多药效。芦丁是一种常见的黄酮类成分，它存在于多种药用植物当中[24～26]，具有抗菌消炎[26]、抗氧化[27]等药理活性。本研究结果显示，芦丁在五年生刺五加根和茎中的含量最高，故其最佳采收期为五年。槲皮苷具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及抗癌等广泛的药理活性[28]。本研究结果显示槲皮苷在五年生茎中含量最高，其次为三年生根，但考虑茎中槲皮苷含量远高于根，故以槲皮素含量为依据，刺五加最佳采收年限为五年。金丝桃苷是药用植物中常见的一种黄酮类次生代谢物，金丝桃苷具有抗急性肝损伤、抗抑郁、抗炎症、抗血栓、抗癌、抗菌、抗氧化应激和抗细胞凋亡等药理作用[29]。研究结果表明，金丝桃苷在三年生刺五加茎中含量最高与五年生无显著性差异，在五年生根中含量显著高于其他年限。由于茎中金丝桃苷含量远大于根，故根据不同生长阶段茎中含量确定培育年限为三年。根据刺五加中黄酮类成分累积规律，获得黄酮类成分的最佳采收年限为五年。

4 结论

本研究发现刺五加根和茎中6种主要药用次生代谢产物含量在不同生长阶段具有明显差异(SPSS软件差异性分析3个生长阶段对刺五加根和茎中主要药用次生代谢产物含量差异较显著，P<0.05)，通过主成分分析(Q值)综合分析6种药用次生代谢产物在不同培育年限及不同部位的累积情况，结果显示五年生刺五加根和茎中6种药用成分的综合得分最高。紫丁香苷、金丝桃苷、槲皮苷的最佳采收年限为五年，刺五加苷E、异嗪皮啶、金丝桃苷的最佳采收年限为三年。研究对不同培育年限刺五加根和茎中6种药用次生代谢产物在不同年限的积累做了初步的研究，可为建立更高效且节约资源的人工培植刺五加模式提供理论依据。由于实验样本仅采集七台河单一产地刺五加，不能反映不同产地间及种质间的差异，有一定的局限性。进一步研究将探索不同产地及培育年限主要次生代谢物含量变化情况，为中药材生产实施种植刺五加确定最佳采收年限及采收期提供理论依据。