耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药机制及检测方法研究进展*

李雪寒 综述，李一荣 审校

(武汉大学中南医院检验科，湖北武汉 430071)

金黄色葡萄球菌常定植于皮肤和鼻腔，致病能力强，能导致皮肤软组织感染、中耳炎、心内膜炎及菌血症等多种感染。20世纪40年代初期，青霉素G应用于临床后显著改善了金黄色葡萄球菌感染的治疗疗效。但是，1942年，临床上就发现了耐青霉素G的金黄色葡萄球菌。1959年，为治疗耐青霉素G的金黄色葡萄球菌感染，临床上引入了甲氧西林，一种半合成的耐青霉素酶的β-内酰胺类抗菌药物，它对产青霉素酶金黄色葡萄球菌有良好的杀伤作用。1961年，JEVONS在英国首次证实了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的存在，此后，临床上MRSA菌株的检出率逐年增长。到1985年，MRSA开始出现暴发性流行，成为全球院内感染的首要病原体。在2011年，仅在美国一个国家，MRSA就造成了超过8万例的侵袭性感染[1]。MRSA感染的高发生率和死亡率已经导致巨大的社会和经济损失。现就MRSA的流行状况、耐药机制和检测方法等研究进展做一综述。

1 MRSA的流行状况

自1961年首株MRSA发现以来，临床上MRSA的检出率逐年升高，到20世纪80年代后期，MRSA已成为全球发生率最高的院内感染病原菌之一。在印度，1999年MRSA的检出率已达80.8%，到2004-2006年，更是增长到了86.5%[2]。在欧洲的罗马尼亚，2015年，MRSA的检出率达到57.2%[3]。还有一些地区，MRSA的检出率虽然不高但呈持续增长趋势。例如澳大利亚，MRSA的检出率由2000年的12.0%上升到2013年的19.0%。在欧洲的塞浦洛斯和斯洛伐克，MRSA的检出率从2012年的35.2%和21.7%分别上升到了2015年的43.4%和28.1%[4]。在我国，从2005年中国细菌耐药性监测开始以来，在检出的革兰阳性菌中，金黄色葡萄球菌所占比例一直都是第1位，在33.0%左右波动，而MRSA又是耐药性金黄色葡萄球菌中最常见的。虽然自2005年以来，我国的MRSA检出率处于下降趋势，但局部区域的MRSA检出率依然在70.0%以上[5]。

20世纪90年代以来，MRSA 所致感染的流行病学发生了显著的变化，不仅局限于医院内，而且呈现出向院外蔓延的趋势，于是提出了MRSA的两种分型，即医院获得性MRSA(HA-MRSA)和社区获得性MRSA(CA-MRSA)。HA-MRSA通常引起住院、免疫力低下或老年患者的感染，这类人群一般是有手术史、经常接触医院卫生设施以及接受抗菌药物治疗的患者。而CA-MRSA则在社区间相互传播，倾向于感染健康的年轻人，这些人在发病前与医疗机构无任何接触。美国德克萨斯州的研究表明,大约70.0%的社区获得性金黄色葡萄球菌的感染均是CA-MRSA[6]。此外，CA-MRSA也可以引起医院感染的暴发，这可能是由于CA-MRSA可以产生杀白细胞素(PVL)造成的[7]。细菌和患者在社区和医院间不断流动,相互传播,导致了复杂的MRSA流行状况。

2 MRSA的耐药机制

2.1葡萄球菌染色体mec基因盒元件(SCCmec)的基本结构和功能 金黄色葡萄球菌通常是通过获得SCCmec而产生对甲氧西林的耐药性。SCCmec为可移动遗传元件，能在葡萄球菌属内菌株间转移。SCCmec的大小为21～67 kb，具有高度多态性。目前，世界范围内共发现11 种 SCCmec(Ⅰ～Ⅺ型)。虽然不同类型的SCCmec的大小和基因组成有所差异，但仍具有以下共同特征[1]：(1)携带一个mec基因复合体，由mec基因及其调控系统组成,与MRSA耐药相关的mec基因为mecA和mecC。(2)携带一个ccr基因复合体，由位于复合体中央的ccr基因和相邻的7～8个开放阅读框(ORFs)组成，其中ccr基因包括ccrA、ccrB和ccrC[8]。ccr编码的重组酶ccrAB或ccrC具有位点特异性，能识别相对应的SCCmec元件，使之从葡萄球菌染色体中精确地分离，并通过转移整合到其他葡萄球菌的菌株中，从而实现SCCmec在葡萄球菌属内菌株间转移[9]。如ccrB结合attB和attS序列能完成SCCmec的剪切或整合，而ccrA尽管不直接参与SCCmec的剪切或整合，但起到促进ccrB对序列的识别作用，因而ccrA和ccrB总是成对出现。而ccrC单独出现即可完成SCCmec的剪切或整合[1]。(3)SCCmec在orfX基因(编码rRNA甲基转移酶)3′端的attB序列处整合入金黄色葡萄球菌染色体组，且SCCmec的插入对orfX的表达没有影响。此外，SCCmec元件还含有3个J区域，主要起连接作用，也可能携带一些其他的抗菌药物耐药决定簇，如转座子Tn554(编码对红霉素的耐药)、质粒pT181(编码对四环素的耐药)、质粒pUB110(编码对氨基糖苷类的耐药)等基因元件。J区域的结构差异性是SCCmec分型的依据[10]。

2.2mecA基因介导的耐药机制 mecA大小为2 129 bp,位于Ⅰ～Ⅹ型SCCmec上，编码一种新的青霉素结合蛋白PBP2a。PBP2a与β-内酰胺类抗菌药物的亲和力很低。因此，PBP2a不受β-内酰胺类抗菌药物的影响，继续发挥细胞壁黏肽合成酶的功能，催化细胞壁的合成，从而导致MRSA的产生[11]。mecA的表达受其相邻的mecR1-mecI系统的调控，这个系统与金黄色葡萄球菌中调控β-内酰胺酶表达的blaR1-blaI系统同源。mecR1编码感受器蛋白MecR1，mecI编码与MecR1相耦联的抑制蛋白MecI。MecR1是一种金属内肽酶原，能通过胞外的青霉素结合区域感受到β-内酰胺类抗菌药物的存在。当β-内酰胺类抗菌药物结合到MecR1的感受器结构域,MecR1被激活,其构象发生改变，诱导胞内感受器区域自动裂解，直接或间接导致MecI分裂，从而阻碍MecI结合到mecA启动子区域,去除MecI对mecA的抑制作用,mecA开始表达,生成大量的PBP2a,使细菌产生耐药性[1]。

2.3mecC基因介导的耐药机制 2007年，在一项关于奶牛乳腺炎的研究中发现了金黄色葡萄球菌菌株LGA251，它具有MRSA的表型，对苯唑西林和头孢西丁耐药，但是对mecA和PBP2a进行验证时却反复显示为阴性。随后对其作全基因组测序显示，LGA251菌株携带一种新型的mecA同源基因，起初命名为mecALGA251，于2012年更名为mecC[12]。在此之后，在瑞典[13]、西班牙[14]、斯洛文尼亚[15]等地相继发现mecC。mecC大小为2 198 bp，位于Ⅺ型SCCmec上，其核苷酸序列与mecA的同源性为69%。BALLHAUSEN等[16]用mecC敲除菌株(W44646ΔmecC)进行实验，发现该菌株对头孢西丁的最小抑菌浓度(MIC)值由16.00 μg/mL下降到4.00 μg/mL，对苯唑西林的MIC值由8.00 μg/mL下降到0.25 μg/mL。将敲除的mecC恢复后，菌株恢复对头孢西丁和苯唑西林的耐药性(MIC值上升为64.00 μg/mL)，从而证明了mecC与MRSA的形成有关。该研究还对mecA和mecC进行了对比研究，发现mecA和mecC的启动子和操纵子的核苷酸序列也有所不同。mecA启动子-10区域的序列为TAT ACT，而mecC该处序列为TAT TAT，该差异可能是导致mecA启动子的活性在转录水平上高于mecC启动子的原因。在MecI的结合位点处，mecA操纵子上包含一个30 bp的回文序列，由2个紧密相连的15 bp序列组成。而mecC操纵子上的回文结构则被一个8 bp的连接肽分为两段14 bp的序列。这些差异表明，mecC的转录调控系统与mecA的存在差异。mecC的调控元件为mecISCCmecⅪ和mecR1SCCmecⅪ，分别编码mecC转录抑制蛋白和感受器蛋白。其编码的蛋白与MecI和MecR1同源性分别为66%和45%[16]。与mecA类似，mecC也编码一种青霉素结合蛋白，称为PBP2c。PBP2c与mecA编码的PBP2a同源性为63%。KIM等[17]对PBP2c的性质进行研究，发现PBP2c具有药物偏好性，相对头孢西丁而言，其对苯唑西林的亲和力更高，其对苯唑西林的亲和力是PBP2a的4倍，因此表现为对头孢西丁的高度耐药，对苯唑西林处于中介耐药甚至是敏感水平，而PBP2a则没有这种现象。此外，两者在热稳定性方面也表现出了差异，在37 ℃时PBP2a的活性最高且稳定，而PBP2c则在25 ℃时表现出稳定的高活性。

2.4fem基因介导的耐药机制 除mecA、mecC之外，金黄色葡萄球菌染色体上还有一些基因也参与MRSA耐药性的产生。这些基因一般与肽聚糖的合成、细胞的分裂和细胞壁的代谢相关。fem就是一种独立于mecA和mecC的基因。与mecA和mecC不同，fem既存在于耐药菌中，也存在于敏感菌中。敏感菌中的fem基因被灭活，可使菌株对β-内酰胺类抗菌药物敏感性提高。目前，已被确定的fem有6种：femA、femB、femC、femD、femE和femF。如femA和femB分别编码FemA和FemB两种胞质蛋白，分别添加第2个和第3个甘氨酸残基以及第4个和第5个甘氨酸残基到细胞壁上的五甘氨酸肽间桥，从而参与细胞壁五甘氨酸肽间桥的形成。当femA和femB失活时,五甘氨酸肽间桥被单甘氨酸取代,使细胞壁肽聚糖成分发生改变，细菌对甲氧西林耐药性降低[18]。femC是谷氨酰胺合成酶抑制因子，当femC失活时，谷氨酰胺合成酶基因(glnA)的转录减少,主干肽链的D-谷氨酸的酰胺化减少，从而使谷氨酰胺生成减少,使细菌细胞壁的正常结构遭到破坏，细菌对甲氧西林的耐药性降低。 femD编码磷酸葡萄糖胺变位酶，催化葡萄糖-6-磷酸与葡萄糖-1-磷酸的相互转化，femD失活会影响肽聚糖前体物质的合成，使细菌对甲氧西林的耐药性降低[19]。

3 MRSA的检测方法

快速精准地检测MRSA对临床抗感染治疗具有重要的作用。MRSA检测方法较多，主要包括MRSA表型检测(苯唑西林以及头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林琼脂筛选法、胶乳凝集法检测PBP2a、显色培养基法等)和MRSA耐药基因检测。2008年，美国临床实验室标准化协会(CLSI)将头孢西丁纸片扩散法列为MRSA的推荐检测方法。2011年，DATTA等[20]比较了5种MRSA表型检测方法的性能，证明头孢西丁纸片扩散法为一种非常好的MRSA表型检测方法，但他们认为还需要使用其他的方法作为补充来提高检测的灵敏度。实验数据显示，乳胶凝集法的灵敏度为100.0%，特异度为99.2%，因此,推荐使用头孢西丁纸片扩散法与乳胶凝集法联合检测。之后，FARAHANI等[21]也通过实验证明了头孢西丁纸片扩散法是临床首选的MRSA检测方法。PCR法检测mecA基因一直以来被认为是检测MRSA的“金标准”。KOUPAHI等[22]对比了PCR法和4种表型检测方法，结果显示，头孢西丁纸片扩散法和PCR法的灵敏度和特异度均为100.0%，苯唑西林纸片扩散法、苯唑西林琼脂稀释法和显色培养基法的灵敏度分别为95.45%、97.22%和98.13%，并认为头孢西丁纸片扩散法可以在没有分子检测设备的情况下作为“金标准”的替代方法用于检测MRSA。

临床上对于MRSA的检测主要是根据MRSA对苯唑西林和头孢西丁高度耐药的表型以及通过验证mecA和PBP2a来判定的。但是，对于mecC MRSA，由于其对头孢西丁高度耐药而对苯唑西林敏感的表型以及mecA和PBP2a阴性，可能会将其误判为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。因此，在进行检测时，选用头孢西丁进行药敏试验比苯唑西林对mecC MRSA的检测结果更准确[23]。当然，仅根据药敏试验结果检测mecC MRSA是不够可靠的。与传统MRSA的检测相似，应用PCR技术验证mecC是检测mecC MRSA的“金标准”。STEGGER等[24]应用多重PCR技术对185株金黄色葡萄球菌同时进行mecA和mecC的检测，结果显示灵敏度和特异度均为100%。此外，该项技术还能同时检测PVL毒力基因和进行spa分型。PICHON等[25]应用四重实时PCR技术同时检测mecA、mecC、PVL毒力基因和nuc，此项技术不仅能精确检测出4种基因，并且能将检测时间缩短到1 h以内，这为临床上检测MRSA提供了更为快速且全面的方法。BECKER等[26]利用Xpert MRSA Gen 3系统联合PCR技术同时检测mecA、mecC和SCCmec-orfX连接区域，这项技术大大增加了MRSA检测的特异度。SEIDEL等[27]将核酸侧流免疫分析(NALFIA)技术与PCR技术相结合用于检测mecA和mecC基因来检测MRSA。相对于普通PCR和实时PCR技术来说，PCR D核酸横向流动免疫检测技术有更精密的检测限度，并可以区分mec的不同等位基因，且耗时较短，这使MRSA的检测向着更精准快速的方向迈进。

4 总 结

MRSA被世界卫生组织列入了2017年“重点致病菌”名单，其所造成的感染在今后相当长时间内依然是棘手的全球公共卫生问题。临床微生物室通常使用纸片扩散法或显色培养法来鉴定MRSA，但是由于mecA和mecC的基因序列与调控序列均存在一定差异，金黄色葡萄球菌体内mecA和mecC表达的PBP2a和PBP2c结合β-内酰胺类抗菌药物的能力不同，从而呈现不同的耐药表型。mecA介导的耐药表型已引起高度关注，但mecC介导的耐药表型(头孢西丁耐药/苯唑西林敏感或轻度耐药)易被忽视甚至误认为甲氧西林敏感，从而导致治疗失败。因此，了解MRSA的耐药机制及其检测方法，特别是mecC基因介导的耐药机制及相应的检测方法，对于指导临床抗感染治疗具有重要意义。