长链非编码RNA与缺氧诱导因子-1在胰腺癌中相关机制的研究进展

陈鹏，周斌，刘恒健，王涛，郭卫东

（青岛大学附属医院 肝胆胰外科，山东 青岛 266000）

胰腺癌是目前世界上预后最差的恶性肿瘤之一，5年生存率不足5%[1]。随着医学技术的发展，胰腺癌治疗方式多种多样，针对胰腺癌的基因靶向药物也不断被发现并应用到临床当中，但近20年来胰腺癌患者预后并未获得显著改善。因此，探索胰腺癌相关发病机制就显得尤为重要。与其他恶性肿瘤不同的是，胰腺癌是一种乏血供并且间质丰富的肿瘤[2]。胰腺癌微环境包括非肿瘤性支持细胞和细胞外间质成分，这些非肿瘤细胞成分和周围的基质共同包围着肿瘤细胞，并且与肿瘤细胞相互作用共同构成了肿瘤的整体[3]。肿瘤细胞的高速复制、肿瘤源性结构以及异常增生的血管是肿瘤组织处于缺氧微环境的前提。尽管这种微环境内的低氧状态不利于组织细胞的增殖和生存，但肿瘤细胞可以通过糖酵解水平升高、肿瘤血管增生、上皮间质转化等一系列应激反应来维持其在乏氧状态下的生存与生长，从而促进肿瘤迁移和传播。此外，人类基因组的分析结果表明，有相当一部分RNA并不编码任何蛋白质，包括核糖体RNA、环状RNA、核内小RNA、长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和小内源性非编码RNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA[4]。近年来人们发现，过去被认为不参与细胞功能的这些RNA，其实与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移相关。最新研究表明，部分lncRNA与缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）在胰腺癌微环境中与肿瘤发生发展存在密切联系[5]，从而为胰腺癌的诊断、治疗和预后的判断提供重要的指标。

1 lncRNA

lncRNA是长度大于200个碱基（kb）且缺乏显著开放阅读框的非编码RNA。最初被研究者认为是转录过程中的“噪音”。与mRNA相比，大多数lncRNA同样由RNA聚合酶II催化转录而来，结构中存在5′端帽结构和3′端多聚（A）尾，但lncRNA中不存在开放读码框，其序列保守程度不高且表达水平较低，组织特异性也更高[6]。最近研究发现表明，这些“暗物质”可能在胰腺肿瘤细胞发育和代谢中起重要作用[7]。lncRNA可以调节包括癌症在内的多种疾病的应答，编码lncRNA的基因广泛分布于基因组中。根据模板的位置和特点，lncRNA可以分为5种类型：正义lncRNA、反义lncRNA、双向lncRNA、内含子lncRNA和长基因间非编码RNA。Wang等[8]将lncRNA的机制归纳为四种模型：（1）模型I（信号），反映转录因子及其下游信号通路对基因的调控；（2）模型II（诱饵），绑定转录因子，阻止与特定DNA序列结合；（3）模型III（向导），征募修饰特定靶基因的酶；（4）模型IV（支架），lncRNA可以聚集多种蛋白质并形成核糖核蛋白复合物。目前人们已经认识到lncRNA在多种疾病中都存在异常表达，随着生物基因芯片、lncRNA与蛋白互作（RNA-proteinpulldown）和免疫共沉淀等研究技术的不断发展，大量与胰腺癌有关的lncRNA被筛选出来，但目前仅有部分lncRNA被研究得较为清楚。

1.1 Gas5

生长抑制特异性基因5（growth arrest-specific gene 5，Gas5）近几年才被发现，其对人类癌症的作用受到了极大的关注和研究。Gas5是抑制肿瘤的lncRNA[9]。有充分的证据表明，Gas5在乳腺癌、前列腺癌和非小细胞肺癌的发展中起到了抑制作用。此外，有结果也发现了包含mir-21、mir-103和mir-222在内的miRNA与Gas5之间在细胞信号传导之间存在新的联系[10]。在胰腺癌细胞增殖中Gas5起到重要作用。Gas5可以降低胰腺癌细胞中CDK6的表达，从而使G0/G1期的细胞数量显着降低，S期的细胞数量显著增加。有研究发现Gas5的高表达显着抑制了胰腺癌的发生和发展，同时伴随着miR-32-5p下降和PTEN增加[11]。

1.2 MALAT1

人肺腺癌转移相关转录物-1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript-1，MALAT1），也被称为核富集转录物-2（nuclear enriched transcript-2，NEAT-2）。这种lncRNA广泛表达于正常人体组织中，并发现在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌和子宫癌等多种癌症中上调。MALAT1还可以通过激发自噬促进肿瘤增殖和转移。MALAT1与人类抗原R（hu man antigen R，HuR）的相互作用刺激HuR的表达。HuR的上调可以在转录水平上调节MTIA-1以促进自噬激活[12]。最近的研究表明胰腺癌患者中MALAT-1的高表达，与癌旁组织相比，癌组织中MALAT-1表达水平较高，提示MALAT-1可能是胰腺癌细胞生长和发展的致癌lncRNA之一[13]。

1.3 PVT1

浆细胞瘤变异易位体1（plasmacytoma variant translocation 1，PVT1）是胰腺癌易感性相关位点之一，PVT1位于人类MYC染色体8q24附近，下游57kb处，位于128806779至129113499之间。PVT1基因通过调控miRNAs、DNA重排以及与MYC基因的协同作用参与人类癌症的发生[14]。越来越多的文献发现，在胰腺癌细胞中PVT1与肿瘤的发生、发展存在密切联系。Wu等[15]提出，与正常组相比，胰腺组织中PVT1表达明显上调。PVT1可以通过下调p21的表达促进在胰腺癌细胞上皮-间充质转化（epithelialto-mesenchymal transition，EMT）的发生。Zhao等[16]研究发现PVT1可以通过调节miR-448促进胰腺癌细胞的增殖和迁移。PVT1的高表达与胰腺癌预后不良有关，它可以通过影响ULK1的表达来影响胰腺癌的发生发展[17]。

1.4 H19

H19是一个新近发现的与胰腺癌相关的lncRNA，在胚胎组织和一系列恶性肿瘤细胞中存在过度表达，如食管癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌和肝转移癌等[18-19]。H19被认为在癌症中具有致癌和抑制肿瘤的特性，H19在许多人类癌症中上调，包括肝细胞癌、膀胱癌和乳腺癌，提示该lncRNA具有致癌功能。在结肠癌中，H19被致癌转录因子c-Myc直接激活，提示H19可能是c-Myc与下游基因表达之间的一种中间介质[20]。相反，肿瘤抑制基因和转录激活因子p53被证明可以下调H19的表达[21]。H19通过H19/let-7/HMGA2/EMT通路在胰腺癌的侵袭、转移中发挥作用[22]。H19是目前最早应用于胰腺癌治疗的lncRNA。H19可以调控表达白喉毒素A链的质粒载体，这种物质被称为BC-819，具有抗肿瘤的作用[23]。在BC-819可以促进膀胱肿瘤体积减小的基础上，Sorin等[24]进一步将BC-819与胰腺癌一线化疗药物吉西他滨联合应用于胰腺癌动物模型中，并取得了较好的疗效。

1.5 HOTAIR

HOX反义基因间RNA（HOXantisenseintergenicRNA，HOTAIR）是最早被发现以反转录形式调控基因表达并且与胰腺癌有关的lncRNA分子，由2185个核苷酸组成，基因序列位于染色体12q13.13的HoxC位点[25]。HOTAIR是与乳腺癌、结肠癌和肝癌患者生存相关的负向预后因子，研究证明患者中HOTAIR表达的增加与乳腺癌和结肠癌转移的增强有关[25-26]。HOTAIR可以与PRC2和LSD1相互作用，HOTAIR 5'端（1～300 nt）与PRC2结合，3'端（1 500～2 146 nt）则与LSD1结合，以达到沉默基因的目的，进而影响肿瘤的发展[27]。相关研究证明HOTAIR在胰腺肿瘤中过表达[28]。最近，Kim等[29]通过基因分析发现，HOTAIR在胰腺癌中的表达要明显高于癌旁组织，HOTAIR高表达的胰腺癌患者呈现出肿瘤侵袭增强、转移范围更加广泛以及预后相对较差的特点。敲除Panc1和L3.6pL胰腺癌细胞系中的HOTAIR可以降低细胞增殖和侵袭能力，改变细胞周期进程并诱导凋亡[30]。此外，HOTAIR的表达与胰腺癌患者的生存时间相关，高表达者一年生存率为55%，而低表达者为91%。

2 HIF-1

HIF-1是一种由结构同源的α亚基和共同的β亚基组成的异二聚体转录因子，由BHLH、PAS、ODDD和TAD四个功能域组成。BHLH结构域介导靶基因与低氧反应元件和二聚体的结合。PAS结构域与BHLH组成的异二聚体蛋白功能界面。ODDD结构域为氧依赖降解部位，HIF-1a在常氧条件下通过泛素-蛋白酶体途径降解。TAD域为末端反活化域，包括N-TAD和C-TAD，参与转录起始复合物的形成和转录的激活。在常氧条件下，HIF-1被脯氨酸羟化酶（protyl hydroxy-lases，PHD）在脯氨酸残基402或564上羟化。在羟化后，脯氨酸残基能被希佩尔-林道肿瘤抑制蛋白（von hippe-lindau tumor suppressor protein，PVHL）识别。泛素化的HIF-1通过蛋白酶体途径迅速降解[31]。然而，在低氧条件下，PHD活性被抑制。HIF-1α与HIF-1β积累并二聚化，形成活性HIF-1复合物[32]。先前的研究表明，低氧条件下的HIF-1能上调葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶的表达。HIF-1通过调节糖酵解酶、乳酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶激酶的表达从而下调线粒体耗氧量，诱导肿瘤细胞对缺氧状况的适应。当氧气水平不能支持线粒体氧化磷酸化时，HIF-1会下调线粒体氧的消耗，并通过丙酮酸脱氢酶激酶1（pyruvate dehydrogenase kinase 1，PDK1）抑制线粒体功能。随着细胞内氧气水平的降低，ATP的产能途径从氧化磷酸化途径转变为不依赖氧气的糖酵解途径[33-34]。在ATP的产生中，糖酵解比氧化磷酸化效率低。然而，由于糖酵解酶活性的增加，使得葡萄糖酵解可以维持细胞内ATP的供应，从而为肿瘤细胞在缺氧状态下提供足够的能量供应[35]。从另一方面来讲，糖酵解这种供能方式也可以减少有氧代谢中活性氧对细胞DNA的破坏，从而间接的对肿瘤细胞起到保护作用。糖酵解酶的表达水平随缺氧程度的升高而升高，此外，也随着乳酸产物的堆积而表达增加。细胞内PH水平可以影响调节细胞增殖、迁移的信号转导。HIF-1在调节细胞内PH上起到关键作用。有研究表明，缺氧条件下HIF-1的过度表达导致NHE1基因表达和增加，从而提高Na+/H+质子泵交换活性，进而调节细胞内PH[36]。

EMT是黏附上皮细胞向可运动间充质细胞转化的过程，首次于鸡胚胎发育过程中提出[37]。在某些类型的癌细胞中，上皮细胞向间充质细胞的表行转化过程可能在转移和侵袭性中起决定性作用[38-39]。细胞在发生EMT形态变化时，将极化上皮表型转化为成纤维细胞样间充质表型。在自然条件下，上皮细胞以拥挤的细胞簇形式存在，保持细胞与细胞的接触。相反，间充质细胞控制松散，迁移倾向增强。最后，这个过程导致癌症转移更快，更具侵袭性[40-41]。已有的研究已经证明了上皮-间质转化在肿瘤缺氧中的重要作用[42]。值得注意的是，低氧条件下胰腺癌细胞EMT过程的特点是N-cadherin、Vimentin、Snail和Twist过表达，E-cadherin抑制[43]。在胰腺肿瘤中，EMT在入侵和代谢过程中起着重要的作用。低氧微环境中HIF-1过表达可促进细胞EMT的表达，引起肿瘤的迁移和侵袭。

低氧条件下肿瘤细胞衍生的非编码RNA在促进血管生成和传播方面也发挥了重要作用。缺氧可激活HIF-1α并诱导自噬，抑制自噬可减轻肿瘤转移。在结直肠癌细胞中，lncRNA CPS1-IT通过灭活HIF-1α抑制由肿瘤组织缺氧条件下诱导的自噬作用，从而抑制结直肠癌的发展。在胰腺癌细胞中，有关实验室研究证明，lncRNA NORAD在缺氧条件下呈高表达，并且通过促进细胞的上皮间质转化促进肿瘤细胞的侵袭和转移。lncRNA NORAD与miR-125a-3p相互作用是胰腺癌发生发展的重要因素。此外，lncRNA NORAD的高表达与患者预后呈负相关，这也提示其可以作为临床预后指标[44]。最近Deng等人[45]的研究证明缺氧诱导下的lncRNA-BX111通过调节ZEB1转录促进胰腺癌的转移和进展，并且ZEB1又恰恰是EMT的关键调控因子。现已经证实：胰腺癌中HIF-1通过诱导缺氧微环境刺激相关lncRNA的高表达，进而来影响肿瘤细胞的侵袭和转移。

3 小结

近些年来，人们通过基因芯片技术发现恶性肿瘤中异常表达lncRNA，进而有目的研究其与胰腺癌的关系。结合相关研究不难发现，lncRNAs在胰腺癌的早期诊断和治疗中有着巨大的潜力，深入研究其功能及其调控机制有助于寻找胰腺癌诊断和治疗的新靶点。另外对于胰腺癌这类乏氧肿瘤，它自身可以通过各种机制来适应这种变化，比如肿瘤细胞内上调HIF-1的表达，增强糖酵解反应，细胞增殖因子表达增强，进一步诱导EMT产生等等。结合缺氧微环境和lncRNA的相关关系，从而探究它们促进胰腺癌进展的多种机制通路，将会成为肿瘤的预防及其治疗一条新的道路。