原发性胆汁性胆管炎中表观遗传诱导的分泌障碍

徐刚 陆伦根

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种慢性缓慢进展的肝脏疾病，与自身免疫异常有关，通过选择性破坏中小胆管，导致肝内胆汁淤积和肝损伤。PBC最常见于中年妇女，男/女比例约1∶1.6～10。

PBC的发病机制目前仍不明确。在过去数十年里，学者认为，环境因素与PBC的免疫耐受缺失及病理发病机制有关。微生物、真菌及病毒的感染，微生物群，污染及辐射等因素被认为是可能的疾病诱发因素。目前认为PBC受多因素、多基因影响，不仅环境因素会导致免疫耐受破坏，遗传易感性及表观遗传同样在PBC的发病机制中起重要作用。

一、遗传易感性

双胞胎的研究发现，单卵双生婴儿中将来PBC的发病率较异卵双生高，高度提示有明显的遗传易感性，但单卵双生也存在不一致，单卵双生子中，患病者和非患病者的基因表达谱出现差异，包括拷贝数变异和DNA甲基化模式的改变。此外，罹患PBC的女性患者中频繁出现X染色体单体，尤其是在B细胞和T细胞，这部分解释了为何女性易罹患PBC。X染色体的丢失有倾向性，通常多见于一侧亲代来源的染色体。因此，在PBC患者中需要进一步的遗传资料分析和X染色体相关的研究以证实并进一步深化对这些遗传改变的理解。

(一)染色体结构的改变 端粒是位于染色体末端的重复DNA结构，和特定蛋白结合。端粒重复结构的丢失导致细胞衰老。研究发现[1]，在慢性病毒性肝炎和PBC时被破坏的小胆管和毛细胆管的胆管内皮细胞(BECs)中，端粒较PBC未被破坏的胆管和毛细胆管的BECs明显变短。端粒失调引起DNA破坏，提示端粒的缩短导致胆管细胞的衰老，可能参与了PBC胆管破坏过程。

(二)PDC-E2免疫耐受性的破坏 PBC与PDC-E2免疫耐受的缺失密切相关。在培养的人BECs细胞的凋亡小泡膜表面发现原生及抗原激活的PDC-E2，形成细胞顶体(apotope)，从而激活免疫系统，BECs凋亡和对凋亡细胞吞噬作用的变化可以很好的解释了PBC的组织特异性和对线粒体抗原耐受性的破坏。很多观点均支持化学复合物和(或)感染因子极有可能通过分子相似和交叉反应机制与耐受破坏有关。

(三)阴离子交换体2AE2和PBC：分泌障碍的关系 早在20世纪90年代早期，Prieto等提出，PBC患者存在胆道碳酸氢盐分泌异常，并与胆汁淤积有关。两种胆汁酸相关治疗可改善胆汁淤积相关的生化和组织学改善，生存期延长[2]。PBC患者肝活检组织和外周血单核细胞中AE2的表达较正常对照明显降低。此外，在PBC患者体内分离培养的胆管细胞中，AE2的活性也较正常人胆管细胞降低。这些资料均提示，PBC患者存在胆道碳酸氢盐分泌过程的损害，导致胆汁淤积。此外，胆管细胞内pH(pHi)的改变可引起严重的细胞功能紊乱和胆管细胞损伤。Ae2a-/b-小鼠可发生自发的严重肝胆损伤和与PBC相似的免疫学表现，包括门静脉内CD4+和CD8+T淋巴细胞的浸润，胆管损伤，胆管细胞氧化应激增加，胆管周围肝纤维化，干扰素γ和IL-12合成增加，血清IgM、IgG和肝ALP水平升高以及血清PDC-E2特异性AMA抗体阳性。PBC免疫细胞中的AE2缺陷也可能在自体免疫现象中起重要作用。ae2缺陷小鼠的CD8+T细胞中，pHi碱性化，细胞增殖和激活增加，程序性细胞死亡蛋白-1表达被抑制，同时伴有细胞凋亡减少，有助于免疫介导的慢性胆管炎的发生。PBC时AE2表达和活性的减少，首先损害胆道碳酸氢盐分泌，导致胆汁淤积和胆管细胞损伤，随后破坏易感胆管细胞的免疫耐受并诱发对胆管细胞的自体免疫，进一步加重胆道损伤和胆管开放。值得注意的是，至今仍未发现在AE2基因座的SNPs，强烈支持PBC时AE2的改变主要通过表观遗传修饰所致。

二、表观遗传和PBC

动态环境变化可能主要通过表观遗传修饰而与患者的表型密切相关。因此，所有周围环境的动态变化均可强烈改变表观基因组，改变基因的表达。对表观遗传过程包括DNA甲基化谱、组蛋白变体、非编码RNAs、翻译后修饰等。

(一)DNA甲基化 芯片技术发现，在非同卵双生子的PBC患者PBMCs中，编码调节钙体内稳态的细胞内Cl-通道CLIC2 和促进有丝分裂调节细胞增殖的肽基脯氨酰顺/反式异构酶的细小病毒家族成员PIN4 mRNA的表达明显下调。一项全基因组研究也证实，在PBC患者的PBMCs中，60个不同基因区域同时存在甲基化谱的变化。值得注意的是，所有这些基因区域在同时罹患疾病的双生子中均存在超甲基化，而未罹患疾病的双生子则没有超甲基化，其中51个基因特异性定位于X染色体，仅9个基因在常染色体有表达。尤其是其中一些超甲基化的基因编码与胆盐及离子运输相关蛋白。

(二)组蛋白变体和翻译后修饰 组蛋白通过翻译后修饰以调节某些特定基因的转录机制。在PBC患者的T淋巴细胞中，逮捕素-1的过度表达促进T细胞增殖，并改变与自体免疫有关的多种基因的表达，增加了在PBC患者中的CD40L、LIGHT、IL-17和IFNGH4基因启动子区域的组蛋白的乙酰化，而TRAIL、APO2和HDAC7A的启动子区域H4组蛋白乙酰化降低。

(三)微小RNAs 微小RNAs(miRNAs)是人类表观遗传因素中研究最多的一种。miRNA表达谱的异常和包括肝脏疾病、胆管疾病、自身免疫综合征等很多的人类疾病有关，许多种miRNA均有差异表达。其中，对PBC患者肝脏和血PBMCs的微阵列分析发现，有超过200种miRNAs的差异表达。其中miR-506是PBC时胆管细胞病理生理学改变的主要参与者之一。

研究发现，PBC患者有35种miRNAs的失调，其中miR-506可能是AE2表达的直接调节者，在PBC患者肝脏内表达上调，并与人特异性AE2-UTR-3’mRNA序列部分互补，定量PCR也证实，PBC患者肝脏内miR-506上调。原位杂交技术则发现，miR-506在肝内胆管细胞中特异性表达，直接和AE2mRNA的结合位点结合，蛋白翻译减少，非Na+依赖性Cl-/HCO3-交换活性降低，促胰液素诱导的顶侧膜氢离子通量减少，高度提示miR-506/AE2轴在调节体内pH稳定和PBC时的胆道碳酸氢盐分泌系统中起关键作用。

在人胆管细胞中诱发miR-506过度表达后，与对照组细胞相比，改变了很多与线粒体能量代谢有关的蛋白，导致线粒体基础呼吸、最大呼吸、ATP相关呼吸和非线粒体呼吸的增加，同时伴有细胞外酸化速率、糖酵解和氧化磷酸化过程的加快，质子漏和线粒体解偶联也和miR-506的过度表达有关，最终因为线粒体活性的损伤而导致ATP水平降低。此外，miR-506的过度表达也抑制了胆管细胞的黏附和迁移，增加细胞应激反应，使胆管细胞对毒性胆汁酸凋亡作用的敏感性增加。值得注意的是，miR-506过度表达的胆管细胞也有PDC-E2蛋白的强烈的异常的过度表达，其表达主要位于细胞质和质膜，提示miR-506、AMAs和自身免疫现象可能存在一定关系。

除了AE2, 和PBC病理发生机制密切相关的另一miR-506的直接靶点是调节胆管细胞内质网质膜Ca2+释放通道的肌醇1，4，5-三磷酸受体3(InsP3R3，也称为ITPR3)。在PBC，胆管细胞表达InsP3R3减少，细胞内Ca2+信号通路和胆道碳酸氢盐分泌受损，激活胆汁淤积。InsP3R3 mRNA含有2个高度保守的miR-506结合位点，调节其表达。因此在miR-506过度表达的胆管细胞中，InsP3R3 mRNA水平和蛋白水平均降低，导致内质网释放Ca2+明显减少，胆道分泌障碍。

(四)长非编码RNAs 长非编码RNAs(lncRNAs)是高度保守的RNA序列，含>200核苷酸，表观遗传性调控基因表达和很多细胞功能。在PBC患者，有38个SNPs定位在lncRNAs。此外，lncRNA AK053349在CD8+T细胞中有高表达，并和T淋巴细胞的激活及自体免疫有关。PBC患者体内的PBMCs中的LncRNA AK053349的表达增加并与Mayo风险评分呈正相关，强调其在PBC病理发生过程中的重要作用，并期待进一步的研究。

(五)环状RNA 环状RNA是一种新发现的普遍存在的内源性非编码RNA(ncRNA)，作为哺乳动物的基因调节者发挥作用。研究发现[3]，PBC患者血清中，有18种环状RNA(circRNA)上调，4种下调，其中hsa_circ_402458、hsa_circ_087631、hsa_circ_406329上调最为明显，而hsa_circ_407176、hsa_circ_082319则明显下调 ，hsa_circ_ 402548在UDCA治疗后的PBC患者血清中明显下降。提示circRNA可能也参与PBC的病理发生机制，并可能是PBC的一个潜在生物标志物。

PBC的病理发生机制比之前的设想更为复杂。遗传易感性、环境暴露及表观遗传的改变共同影响疾病发生、发展，而表观遗传年代开启了PBC新的研究方向，进一步加深了对这一复杂疾病的认识。