药物性肝损伤体外检测平台的研究进展

药物性肝损伤(DILI)是指由各类处方或非处方的化学药物、生物制剂、传统中药、天然药物、保健品、膳食补充剂及其代谢产物乃至辅料等所诱发的肝损伤。在中国成年人中，有10%～50%的丙氨酸氨基转移酶升高是由药物引起的。DILI也是导致药物研发终止和撤药的常见原因。DILI根据发病机制分为固有型DILI(InDILI)和特异质型DILI(IDILI)两种，前者是可预测的，个体差异不显著，而后者与个体对DILI的敏感度有关，个体差异显著，是不可预测的。如何在药物上市前预测该药的肝毒性，如何在个体用药前评估其发生IDILI的风险，从而指导个体精准用药，是目前关于DILI的研究热点。本文结合药物在肝脏内的代谢过程，就IDILI体外检测平台的研究进展作一综述。

1 药物在肝脏内的代谢过程及IDILI的发病机制

1.1 第Ⅰ相反应

在肝细胞内，非极性药物在Ⅰ相药物代谢酶(ⅠDME)的作用下，通过氧化、还原和水解等反应，转化为活性形式发挥作用。ⅠDME属于细胞色素P450(CYP450)氧化酶家族。CYP450对药物的代谢具有双向性，主要代谢途径是对药物原型进行灭活或脱毒，而次要代谢途径则可能使原型化合物进行致毒或致癌活化等。由于CYP450存在基因多态性，部分个体在代谢过程中会积蓄有毒或致癌物质，造成肝损伤；或原本没有抗原性的药物经肝脏转化成具有抗原性的代谢产物，引起免疫性肝损伤。有研究报道，来氟米特介导的肝毒性与CYP2C9*3基因型相关[1]。

1.2 第Ⅱ相反应

肝细胞内，药物分子的极性基团(大部分是经ⅠDME代谢产生的)在Ⅱ相药物代谢酶(ⅡDME)的作用下，与内源性化合物经共价键结合，生成极性大、水溶性高的化合物，经胆汁排泄。部分药物通过ⅡDME解毒，如果ⅡDME基因突变，ⅡDME的活性下降，将会导致IDILI。葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)是体内催化葡萄糖醛酸与底物结合的重要的ⅡDME。UGT1A1基因启动子TATA盒区域TA重复序列的基因多态性，导致随着TA重复序列的增加，酶的表达及活性下降，影响相关药物的代谢，其中典型的是尼洛替尼。研究发现，应用尼洛替尼治疗的患者中，含7个TA重复序列的纯合子TA(7)TA(7)(即UGT1A1*28)基因型发生高胆红素血症的概率明显高于含6个TA重复序列的纯合子TA(6)TA(6)基因型和杂合子TA(6)TA(7)基因型，提示临床上对于UGT1A1*28等位基因患者应慎用尼洛替尼，防止出现高胆红素血症[2]。

1.3 第Ⅲ相反应

药物或代谢产物经由药物跨膜转运体排至胆汁或血液循环中。药物转运体位于肝细胞顶端或肝小管膜上，药物经由它的转运出入肝细胞。转运体蛋白的基因变异可导致肝脏疾病，其功能障碍还会引起药物在体内蓄积，这也是IDILI的发生机制之一。检测这些药物跨膜转运蛋白的活性对于预测个体对药物的易感性具有重大意义。

1.4 脂质过氧化损伤

肝细胞的脂质过氧化损伤是IDILI的重要发病机制之一。脂质过氧化反应产生的活性氧能造成肝细胞损伤。细胞线粒体中存在多种抗氧化酶，能拮抗活性氧引起的脂质过氧化损伤，比如超氧化物歧化酶2，其基因变异可增加肝脏对抗结核药物的易感性，导致药物在肝脏内蓄积，引起肝内胆汁淤积[3]。

1.5 免疫反应

第Ⅰ相反应生成的中间代谢产物作为半抗原，能被肝内淋巴细胞识别，启动针对该半抗原及肝细胞的炎性反应，导致急性肝损伤和药物诱导的自身免疫性肝炎。另外，肝内吞噬细胞能吞噬坏死或凋亡的肝细胞，将其作为抗原递呈给主要组织相溶性复合体(MHC)，后者再通过T淋巴细胞启动免疫反应，释放多种细胞因子，包括炎性细胞因子[如γ-干扰素(γ-IFN)、白细胞介素-1α(IL-1α)等]，以及具有抗炎作用的细胞因子(如IL-4、IL-10等)，当两种细胞因子作用失衡，就会导致DILI。在对乙酰氨基酚引起的DILI中，IL-1α和γ-IFN的表达水平升高；IL-4和IL-10的基因突变能使双氯芬酸诱导的DILI风险升高[4]。MHC由人类白细胞抗原(HLA)基因编码，HLA是目前已知的人类染色体中基因密度最高、多态性最为丰富的区域，在不同的种族或同一种族不同群体中的分布有明显的种群特征，从而导致个体对药物的反应不一，这也是IDILI的发病机制之一。

2 IDILI的体外检测平台

近年来，有关IDILI体外检测平台的研究取得了较大进展。这对于IDILI的诊断、药物上市前的肝毒性预测和评估有较大意义，下文将从基因水平、细胞水平和组织水平分别对各检测平台作一介绍。

2.1 基因水平的IDILI检测平台

全基因组关联研究(GWAS)揭示了HLA基因多态性与IDILI的相关性，证实了由于风险等位基因的存在，使个体有更高的患IDILI风险，对于指导个体化用药有重大意义。

阿巴卡韦(abacavir)是治疗艾滋病的药物，接受该药治疗的患者中约有4%发生过敏反应，部分过敏反应是致死性的，GWAS已经证实HLA-B*5701等位基因与患者对阿巴卡韦的高敏反应有关，美国食品和药品管理局(FDA)推荐应在进行阿巴卡韦治疗前检测HLA-B*5701等位基因情况，相关的试剂盒已经商品化，这是将药物遗传学应用于指导药物临床应用的成功案例[5]。氟氯西林是一种半合成青霉素，该药可导致胆汁淤积型DILI。研究表明，有HLA-B*57∶01等位基因的患者应用该药时，发生DILI的概率是没有该等位基因的患者的81倍。尽管研究结论令人鼓舞，但是氟氯西林所致肝损伤的发生率仅8.5/100 000，使得该等位基因检测试剂盒的临床应用价值有限[6-7]。米诺环素是一种半合成的四环素，基于白种人的研究表明HLA-B*35∶02等位基因与米诺环素引起的肝损伤密切相关[8]，但由于米诺环素引起的DILI发病率较低，且HLA-B*35∶02等位基因阳性率在白种人中仅为0.3%，在非裔美国人中甚至仅为0.1%，使得该等位基因预测米诺环素引起的DILI的价值不高，但是可用于鉴别米诺环素引起的DILI与自身免疫性肝炎[9]。

2.2 细胞水平的IDILI检测平台

2.2.1 单细胞平台 目前原代人类肝细胞被认为是预测DILI最好的单细胞模型。但该细胞来源不易，制备成本高，且在体外培养中会迅速失去关键功能，使其应用受限[10-11]。利用能表达药物代谢酶、转运蛋白和氧化/抗氧化酶的永生化细胞系模拟肝脏细胞，进行药物代谢研究，具有成本低、可调控和重复性好的优点。其中常用的是THLE细胞，它是利用SV40大T抗原转化使上皮细胞永生化形成的细胞系。该细胞系中DME的表达量较低，研究者可以利用转基因方法使其表达特定组合的DME，观察药物的代谢情况，并制成剂量-效应曲线[12]。Leite等[13]使用CYP450转基因的THLE细胞成功评估了多种药物的DILI风险。HepaRG细胞是来源于人肝前体细胞系的终末分化肝细胞，保留了多种原代肝细胞的特征，包括DME、药物转运蛋白体、核受体的表达等[14]。Mueller等[15]发现HepaRG细胞在悬浮的液滴状态下具有三维生长潜能，且其中DME关键酶的表达远大于单层细胞状态。

Benesic等[16]开发了MetaHeps系统，该系统利用来源于受试者外周血的单核细胞衍生的肝细胞样细胞(MH细胞)对药物进行肝毒性检测。由于该MH细胞具有受试者的个体特征，故MetaHeps系统适用于IDILI的检测，并可用于研究药物之间的相互作用[17]。研究发现，MetaHeps系统诊断多药共用状态下IDILI的敏感度和特异度均高于临床上常用的RUCAM诊断量表；对31例IDILI患者(实验组)和23例非DILI患者(对照组)的MH细胞进行可疑药物的肝毒性检测，结果实验组有29例检测到了药物肝毒性，而对照组中无1例出现肝毒性，表明MetaHeps系统诊断和预测IDILI的敏感度和特异度都较高；1例IDILI患者同期服用84种药物，利用该患者的MH细胞对84种可疑药物进行检测，仅4种药物呈阳性表达，表明MetaHeps系统有助于明确多药共用IDILI患者的致病药物[18]。中国已进入老龄化社会，老年人常罹患多种疾病，需同时服用多种药物，而大部分药物通过肝脏代谢，在老年人多药共用状态下如何预防及诊断IDILI是临床医生面临的棘手问题，MetaHeps系统无疑可作为一项实用的方法。

利用干细胞技术制备的人类细胞筛查腺瘤检出率是预测IDILI的一种有前景的方法。随着可诱导的多能干细胞(iPSC)问世，使利用个体的iPSC进行IDILI预测成为可能。干细胞具有多向分化潜能，如何使个体的iPSC分化为所需要的肝脏细胞是首先需要解决的问题。iPSC可以分化为肝细胞样细胞(HLC)，Szkolnicka等[19]的研究表明分化的iPSC能表达CYP1A和CYP3A，并与体外培养的冻存肝细胞表现出相似的药物应答。但是，HLC目前还无法具有完全成熟的肝细胞表型[20]。

IDILI的复杂性意味着目前没有任何一种单细胞模型能够充分模拟DILI的全过程，不论这种细胞是原代人肝细胞、肝细胞系还是来源于干细胞。尽管如此，模拟肝细胞主要特征的单细胞模型在评估潜在的肝损伤风险方面还是具有价值的，对于建立复杂的多细胞肝脏模型也是至关重要的。

2.2.2 肝脏细胞的共培养体系 肝组织中除了肝细胞，还有胆管细胞、间质细胞和多种免疫活性细胞。Kostadinova等[21]应用多孔层状尼龙支架培养肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞和内皮细胞，制成共培养体系，该体系内的细胞能够沿着尼龙支架生长成三维结构，具有正常肝组织的功能，并能维持11周，通过向支架中加入脂多糖能诱导产生炎性细胞因子。此研究利用该体系成功检测了CYP450活性和肝细胞对药物的摄取。另有研究者利用成纤维细胞和肝细胞共培养来模拟肝脏的微环境，但由于该体系内细胞是单层培养，而且仅有两种细胞，缺乏多样性，不能反映真实的肝组织环境，在检测药物肝毒性过程中出现的假阴性较多[22]。有研究者用基质细胞代替该体系中的成纤维细胞，结果也不容乐观[23]。Rose等[24]将肝细胞和库普弗细胞置于24孔胶原涂层板内共培养，成功模拟了肝脏的炎性反应。利用该共培养体系可以对CYP450的活性和免疫反应进行检测。Chen等[25]报道利用原代人肝细胞构建的多细胞共培养体系对19种已经被FDA证实的肝毒性药物进行检测，发现其预测药物肝毒性的敏感度达100%。

随着微流体技术、生物打印技术和组织工程技术的不断发展，研究者已经不满足于仅将肝细胞和肝脏非实质细胞混合培养的二维共培养体系。肝组织缺血缺氧会影响肝细胞功能，为了模拟血供对肝细胞代谢能力的影响，自2010年以来，多个研究团队对包含肝细胞和肝脏非实质细胞的微流体共培养装置进行了研究，在这个装置中，培养肝脏细胞的微环境是液态的，而且它的氧供和流动性等参数是可调节的。研究者发现，肝细胞和肝脏非实质细胞在微流体共培养体系中生长，肝细胞的I DME活性明显高于静态的共培养体系以及不含非实质细胞的微流体培养体系。另外，该共培养体系能成功形成胆小管，并可以检测转运蛋白的活性，它的缺点在于不能进行高通量的药物筛选，目前只用于实验室研究[26-27]。据报道，利用组织工程技术和新型生物材料构筑球形基质，将肝脏细胞置于其中的微小通道内进行培养，模拟肝脏的三维结构和功能，能模拟肝脏脂肪变性和胆汁淤积[28]，已有学者将其用于DILI的研究[20]。有研究者利用组织工程技术制备半乳糖基纤维海绵，将人多能干细胞分化的肝细胞样细胞(hPSCHLC)用于对乙酰氨基酚、曲格列酮和氨甲喋呤的肝毒性检测，发现其敏感度明显优于传统方法培养的hPSCHLC。

非阿尿苷是礼来公司开发的治疗乙型肝炎的抗病毒药物，在动物实验中并未发现严重的肝毒性不良反应，但是在Ⅱ期临床试验中，15例服用该药的患者中有7例出现肝衰竭，其中5例死亡，该药的临床试验于1994年停止。2011年，Krzyzewski等[29]利用原代人肝细胞和基质细胞构建微模态共培养体系，成功检测出非阿尿苷的肝毒性，提示利用多细胞共培养体系预测DILI具有光明前景。此共培养体系由于构建复杂，导致成本较高。

2.3 组织水平的IDILI检测平台

利用体外培养的精密肝组织切片进行DILI研究，更接近真实的肝脏微环境，能反映肝组织内不同细胞间相互作用和肝组织对药物的整体代谢过程，相对于多种细胞的共培养体系，其优点显而易见。Hadi等[30-31]将鼠和人的肝组织切片进行体外培养，成功构建了肝脏炎性损伤模型，已应用于DILI、脂肪肝、肝纤维化的研究中。该系统的缺点在于获得肝组织切片的过程是有创的，而且组织切片中肝细胞的代谢能力显著下降，研究者认为肝细胞代谢能力的下降与切片处于静态的培养体系有关，于是将肝组织切片置于微流体培养装置中进行培养，发现肝细胞功能得到了良好的维持[32]。

为了更好地模拟肝细胞在体内的生长环境，有研究者将原代人肝细胞原位种植或者异位种植在啮齿类动物体内，用于DILI的检测。TK-NOG小鼠能耐受高剂量的非阿尿苷，但原位种植在该小鼠肝脏上的原代人肝细胞表现出与非阿尿苷用药剂量相关的肝毒性[33]。此检测方法不适用于检测由于免疫机制引起的DILI。

3 总结和展望

IDILI具有不可预测的特点，其诊断难度较大。DILI体外检测平台对于DILI，特别是IDILI的临床诊治、个体化用药指导和药物研发具有重要意义。虽然已有针对发病机制单个环节开发的高通量检测试剂可用于IDILI的预测，但能够同时模拟药物肝脏代谢的整个过程，并具有参数可调控的多细胞或组织平台对于IDILI的预测无疑更有特异性，这是未来的研究方向。