柠檬叶精油的抗氧化活性及其相关性分析

陈林林，李伟，韩可，吴嘉树

（哈尔滨商业大学 省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076）

柠檬叶是黎檬或者洋柠檬的叶，作为独特香辛料被使用在东南亚菜品中，清香味道十分强烈，用于海鲜、肉类和沙拉类菜品中，使菜肴更加鲜美。柠檬叶中含有黄酮类、有机酸、香豆精类等成分，其中主要包括槲皮素、根皮素、阿魏酸、香荚兰酸、p-香豆酸、水杨酸、伞形花内酯、龙胆酸和o-香豆酸等，大部分以结合形式存在，少部分物质以游离形式存在，例如伞形花内酯、阿魏酸和水杨酸等。此外，柠檬叶中还含大量的挥发油、维生素和叶绿素等［1］。柠檬精油的气味清新、强烈，淡黄绿色，水质粘性，挥发性好。柠檬叶精油含有多种活性成分，主要为单萜烯类、醇类、醛类化合物。由目前研究可知，柠檬挥发性成分的开发利用主要在鲜果果皮精油的提取，柠檬叶中芳香性成分的研究较少，主要集中在提取方法和优化提取工艺等方面，例如超临界 CO2、流体萃取［2］、微波辅助提取［3］、超声波辅助 提取［4］、超声波协同微波提取等［5］；并采用气相色谱-质谱（GC-MS）法分析、鉴定柠檬挥发油成分［6－8］。但是对柠檬叶精油成分的功能特性研究却非常少。这些实验大部分是针对柠檬果皮的精油提取的而开展的，对柠檬叶精油的提取的研究少之又少，除了木里柠檬叶精油外，其他鲜有报道。因此，若能合理开发利用柠檬叶中所含的有效成分，使大批量的柠檬叶不被当成废弃物扔掉，不仅促进柠檬产业链的延伸和发展，而且能增加柠檬树的经济附加值［9］。

本文采用水蒸气蒸馏法提取柠檬叶精油，分别对从鲜柠檬叶和干柠檬叶中提取的精油进行对比，以Vc（抗坏血酸）和BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）作为对照，对柠檬叶精油和萃取物清除自由基能力、清除亚硝基能力、总还原能力、抑制黄嘌呤氧化酶活性的能力进行测定。对比评价精油与残渣萃取物的功能性，旨在为柠檬叶的综合利用提供依据。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

鲜柠檬叶、干柠檬叶：购自广州聚鲜林贸易有限公司，产地广西；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）：日本东京化成株式会社；黄嘌呤氧化酶：上海源叶生物科技有限公司；黄嘌呤：北京恒业中远化工有限公司；抗坏血酸：天津市博迪化工有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）：南京信帆生物技术有限公司；邻苯三酚：天津市科密欧化学试剂有限公司。

W501升降恒温油浴锅 上海申胜生物技术有限公司；HZS-H恒温水浴振荡箱 上海晶坛仪器制造有限公司；R-1001型旋转蒸发仪 上海道京仪器有限公司；BS210S电子天平 德国Sartorius仪器公司；UV 5100B型紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；DHG-9203A型电热恒温鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器有限公司；PHS-260型酸度计 北京普析通用仪器有限责任公司；DC-2006低温恒温槽 宁波市海曙天恒仪器厂。

1.2 柠檬精油的提取

分别将干柠檬叶放入摇摆式高速万能粉碎机中粉碎至粉末状，将鲜柠檬叶剪至约1cm2的小碎块，备用。取200g粉碎的干柠檬叶或300g（包括梗）上述剪碎的鲜柠檬叶放入水蒸气提取装置的2000mL三口烧瓶中，按照物料比1∶8加入蒸馏水1600mL。安装水蒸气蒸馏装置，打开低温恒温槽，将温度设置为－4℃开始制冷，等温度降低至设定温度后，打开循环开关让液体在冷凝管内循环起来，然后加热油浴锅。油浴锅温度设定为由80℃逐渐升高，直至沸腾回流，这时油浴锅温度为120℃。蒸馏时间为3h（以第1滴液体出现开始计时）［10，11］。从收集管中的馏出液中冷却分离出上层精油，装入密闭精油瓶，放入冰箱中冷却1夜，用胶头吸管吸出精油中析出的少量水分，得到无色透明的精油。

1.3 纯化后的柠檬叶精油抗氧化活性研究

1.3.1 清除DPPH自由基活性的测定

取系列浓度为1，2，3，4，5mg／mL的样品乙醇溶液、BHT乙醇溶液和抗坏血酸乙醇溶液0.1mL，加入到3.9mL浓度为6×10－5mol／L的 DPPH 乙醇溶液中，28℃下水浴10min，然后迅速在517nm波长下测定吸光度值。同时测定不加提取物的空白样品的吸光度值，按公式（1）计算 DPPH 自由基的清除率（%）［12，13］：

式中：SC1为DPPH自由基的清除率；A样品为样品的吸光度值；A空白为空白样品的吸光度值。

1.3.2 清除羟自由基活性的测定

精确移取浓度为5mmol／L的邻二氮菲溶液1.5mL，再加入浓度为50mmol／L pH 7.4的磷酸缓冲溶液2mL，充分混匀，滴加1.0mL浓度为7.5mmol／L的硫酸亚铁溶液，立即混匀，分别加入1mL各系列浓度为1，2，3，4，5mg／mL的样品溶液、BHT、抗坏血酸，最后加入1.0mL质量浓度为0.1%的H2O2启动反应。样品管用水补体积至10mL，损伤管中加H2O2不加样品溶液，未损伤管两者都不加，损伤管和未损伤管都用水补充体积至10mL，将各管均置于37℃水浴中1h，拿出后迅速在波长536nm处测定吸光度值［14］。根据公式（2）计算羟自由基的清除率：

式中：SC2为羟基自由基的清除率；A0为未损伤管的吸光度值；A1为损伤管的吸光度值；A2为样品管的吸光度值。

1.3.3 清除超氧阴离子自由基活性的测定

分别取1mL系列浓度为1，2，3，4，5mg／mL的样品溶液、BHT溶液、抗坏血酸溶液，加入6mL浓度为50mmol／L的 Tris-HCl（pH 8.2）缓冲溶液，25℃下水浴20min，取出后立即加入0.1mL 25℃下预热的10mmol／L邻苯三酚溶液，精确反应4min后，立即加入0.1mL浓度为6mol／L的盐酸停止反应，以蒸馏水为参比溶液，在325nm波长下测定吸光度值［15］。用等体积的10mmol／L盐酸代替邻苯三酚调零，每一个样品对应一个空白。根据公式（3）计算超氧阴离子自由基的清除率：

式中：SC3为超氧阴离子自由基的清除率；A0为对照组的吸光度值；A1为样品组的吸光度值。

1.3.4 采用重氮偶合比色法测定清除NO2－活性

分别取0.5mL浓度为1，2，3，4，5mg／mL的样品溶液、BHT、抗坏血酸样品液，分别加入1.0mL柠檬酸缓冲溶液（pH 3.0）和1.0mL 浓度为10μg／mL的亚硝酸钠标准溶液，在37℃恒温水浴中反应1h，取出后加入15mL蒸馏水，再加入1mL浓度为4mg／mL的对氨基苯磺酸溶液，摇匀，静置5min。加入0.5mL浓度为2mg／mL的盐酸萘乙二胺溶液，用蒸馏水定容到刻度线，摇匀，静置15min，在546nm波长下测得吸光度值［16］。通过标准曲线求出对应的亚硝酸钠含量，根据公式（4）计算超氧阴离子自由基的清除率：

式中：SC4为亚硝酸根自由基的清除率；m1为亚硝酸钠的加入量，μg；m2为亚硝酸钠的残留量，μg。

1.3.5 总还原能力的测定

分别取1mL浓度为1，2，3，4，5mg／mL的样品溶液、BHT、抗坏血酸样品液，加入2.5mL磷酸缓冲溶液（200mmol／L，pH 6.6）以及2.5mL 浓度为1g／dL的铁氰化钾溶液，混匀。50℃恒温水浴20min后，迅速冷却，加入2.5mL浓度为10g／dL的三氯乙酸溶液，离心。取2.5mL上清液，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL浓度为0.1g／dL的三氯化铁溶液。静置10min后，在700nm波长下测量吸光度。每个样品都做对应的空白背景值测定（实验步骤中用蒸馏水代替铁氰化钾溶液）。还原能力用抗坏血酸当量AEE（ascorbic acid equivalents）表示，单位μg AEE／mL。

1.3.6 抑制黄嘌呤氧化酶活性的测定方法

精确吸取3.75mL浓度为50mmol／L的磷酸盐缓冲液加入50mL锥形瓶中，再加3mL 0.15mmol／mL的黄嘌呤溶液，混匀后立即在290nm下测定吸光度值，记为A0。调节水浴振荡的条件25℃，100r／min，将测完吸光度值的锥形瓶放入其中反应30min，最后加入1.25mL 1mol／L的 HCl终止反应，再次测定吸光度值，记为A30［17］；体系中加入1mL 18mU／mL的黄嘌呤氧化酶，测定290nm下的吸光度值，按是否终止反应分别记为AE0和AE30；体系中加入1mL不同浓度梯度的各样品溶液，测定290nm下的吸光度值，按是否终止反应分别记为AS0和 AS30；体系中既加入1mL 18mU／mL黄嘌呤氧化酶，又加入1mL各样品溶液，测定290nm下的吸光度值，按是否终止反应分别记为 A（E＋S）0和 A（E＋S）30（以甲醇为对照组）。

根据公式（5）计算不同浓度梯度的各样品溶液抑制黄嘌呤氧化酶活性的抑制率：

2 结果与分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

图1 各浓度样品清除DPPH自由基能力的变化曲线

由图1可知，柠檬叶精油在浓度2.0～10.0mg／mL的范围内，对DPPH自由基的清除率总体呈上升趋势（P＜0.05）。Vc的清除率最大达到90%以上，但趋势较为平缓，BHT的增加幅度由急到缓，逐渐趋近Vc；鲜叶精油和干叶精油清除DPPH自由基的能力相较于同浓度的VC和BHT较弱，其中干叶精油清除DPPH自由基的能力比鲜叶精油的清除能力略强，二者上升趋势一致；萃取物的清除能力相较于同浓度的VC和BHT较弱，与柠檬精油基本相近。

表1 各样品清除DPPH自由基的IC50值

由表1中各实验样品的IC50值可以直观地看出所测试的样品清除DPPH自由基的能力，各样品的IC50值差别不大，可表示为：VC＜BHT＜干叶精油＜鲜叶精油。可以看出BHT和VC的IC50值较小，清除能力较强，鲜叶精油和干叶精油的IC50值较大，清除效果一般，因此，柠檬叶精油在清除自由基方面均有清除作用，但清除作用相较于VC和BHT较弱。

2.2 清除羟基自由基的能力

图2 各浓度样品清除羟基自由基能力的变化曲线

由图2可知，各样品在浓度范围2.0～10.0mg／mL内，羟基自由基的清除率大体呈上升趋势（P＜0.05）。VC和BHT清除羟基自由基的能力随着浓度的增大而增大，在浓度最大处，BHT清除率达到95.29%；相同条件下，鲜叶精油增加幅度较为平缓，与同浓度的干叶精油相比，清除羟基自由基的能力略强；同浓度梯度的柠檬精油的清除能力超过同浓度下的BHT和VC，其清除能力上升趋势缓慢，但在低浓度时二者就可以明显地清除羟基自由基，随着浓度的不断增加，二者清除率也呈现上升趋势。

表2 各样品清除羟基自由基的IC50值

表2中各实验样品的IC50值可以直观地看出所测试的样品清除羟基自由基的能力，各样品的IC50值差异较大，鲜叶精油＜干叶精油＜BHT＜VC。可以得出，柠檬精油具有较强的清除羟基自由基能力，清除效果超过VC和BHT。

2.3 清除超氧阴离子自由基的能力

图3 各浓度样品清除超氧阴离子自由基能力的变化曲线

由图3可知，各样品在浓度范围2.0～10.0mg／mL内，超氧阴离子自由基的清除率无规律，多处出现转折点，大部分呈现缓慢下降趋势（P＜0.05），VC和BHT清除率在44%～60%之间，清除超氧阴离子自由基的能力一般，但随着浓度的不断增大，清除率缓慢上升；鲜叶精油清除超氧阴离子自由基的能力较好，增加幅度较为平缓，且在中间出现最低点；干叶精油在8～10mg／mL时快速增加，最后超过VC和BHT；干叶精油和鲜叶精油均在较低浓度时就有较好的清除率，均超过同浓度的VC和BHT。

表3 各样品清除超氧阴离子自由基的IC50值

由表3可知，样品对超氧阴离子自由基清除能力的半数抑制浓度，实验样品的IC50值差异不大，鲜叶精油＜BHT＜干叶精油＜VC。

2.4 清除亚硝酸盐活性的能力

图4 各浓度样品清除亚硝酸盐能力的变化曲线

由图4可知，鲜叶精油和干叶精油对亚硝酸盐的清除能力基本相同，上升趋势一致并且都在较低浓度时就呈现出良好的清除率，但相比VC和BHT，鲜叶精油和干叶精油的清除能力略弱于VC和BHT。

表4 各样品清除亚硝酸盐的IC50值

由表4可知，样品对亚硝酸盐清除能力的半数抑制浓度，实验样品的IC50值差异不大，BHT＜VC＜干叶精油＝鲜叶精油。

2.5 总还原能力的测定

图5 各浓度样品总还原能力的变化曲线

由图5可知，各样品在浓度范围2.0～10.0mg／mL内，总还原能力总体呈上升趋势（P＜0.05），个别点出现下降。VC的总还原能力较为平缓，BHT的上升幅度大且快速，浓度最大时达到最高点；干叶精油和鲜叶精油总还原能力较弱，远远低于BHT，二者趋势较为平稳且一致。发现柠檬鲜叶精油的清除能力较弱，其原因是柠檬鲜叶精油受pH值的影响较大，反应环境的pH值限制了其抗氧化活性。

2.6 抑制黄嘌呤氧化酶活性的测定

图6 各浓度样品抑制黄嘌呤氧化酶活性曲线

由图6可知，各样品在浓度范围2.0～10.0mg／mL内，抑制率曲线变化趋势无规律，多个测定点出现转折（P＜0.05）；VC在较低浓度时具有较好的抑制黄嘌呤氧化酶作用，随着浓度的增加而快速降低；BHT抑制黄嘌呤氧化酶的抑制率随着浓度的增加而增大，浓度越大，上升越缓慢；柠檬鲜叶精油和柠檬干叶精油抑制黄嘌呤氧化酶活性一般，最大抑制率约为45%，二者总体呈上升趋势，但个别点出现异常。因此，柠檬精油具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，但活性一般。

2.7 各活性指标的相关性分析

数据采用SPSS 19.0统计软件进行相关性分析，用Pearson进行显著性检验，以P＜0.05为显著性检验标准，评价各种测定方法间的相关程度。柠檬叶精油及其萃取物的抗氧化性评价方法的相关性分析见表5和表6。

表5 干叶精油6种抗氧化性评价方法的相关性

由表5可知，干叶精油的6种测定抗氧化活性的评价方法中，羟基的清除能力与NO－2的清除能力的线性相关显著（P＜0.05），其他活性指标间相关程度不明显。

表6 鲜叶精油6种抗氧化性评价方法的相关性

由表6可知，鲜叶精油的6种测定抗氧化活性的评价方法中，羟基自由基的清除能力与NO2－的清除能力的线性相关显著（P＜0.05），总还原能力与NO2－的清除能力的线性相关非常显著（P＜0.01），其他活性指标间相关程度不明显。

3 结论

采用水蒸气蒸馏法提取柠檬鲜叶和柠檬干叶中的精油，通过对柠檬叶精油清除DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基、亚硝酸钠、总还原能力以及抑制黄嘌呤氧化酶活性能力的测定，发现柠檬叶精油对各种自由基的清除效果有差异，鲜叶精油对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除能力较强，优于BHT和VC。干叶精油和鲜叶精油对羟基自由基的清除能力与NO2－的清除能力之间相关关系显著（P＜0.05），且鲜叶精油的总还原能力与NO2－的清除能力之间的相关关系非常显著（P＜0.01）。综上，柠檬叶精油具有较好的抗氧化活性，可对其活性加以利用。