秦皮对去卵巢所致大鼠骨质疏松症的治疗作用及机理探讨❋

刘梅洁，鞠大宏，王瑞海，孙 刚，潘静华，李 艳，刘 红，王少君，苗 青，许 京，刘丽梅△

(1. 中国中医科学院医学实验中心，中医药防治重大疾病基础研究北京市重点实验室，北京 100700；2. 中国中医科学院中医基础理论研究所, 中医方证基础研究中心， 北京 100700)

秦皮是传统中药材，《神农本草经》记载秦皮“主风寒湿痹”。骨质疏松症属于中医骨痹、骨痿范畴。本研究采用经典的去卵巢所致骨质疏松症模型，对秦皮治疗骨质疏松症的作用进行了初步评价，以期为进一步深入研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物

选用健康雌性SPF级SD大鼠40只，体质量(200±20) g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证编号SCXK-(军)2012-0004)，在中国中医科学院中医基础理论研究所清洁级实验动物室饲养(实验动物室许可证号SYXK(京)2010-0032)。

1.2 药物

秦皮药液：秦皮饮片3 kg，按优选工艺(加9倍量水，煎煮3次，每次1.5 h)药液合并，减压回收溶剂，浓缩至0.67 g生药/ ml。

1.3 试剂

戊巴比妥钠，德国MERCK公司(批号20131206)；盐酸四环素，北京索莱宝科技有限公司(批号1104B047)；甲基丙烯酸甲酯，天津市福晨化学试剂厂(批号20140427)；甲基丙烯酸丁酯，天津市福晨化学试剂厂(批号20130417)；聚乙二醇400，天津市福晨化学试剂厂(批号20110527)；苯甲酸甲酯，国药集团化学试剂有限公司(批号20120627)；过氧化苯甲酰，北京益利精细化学品有限公司(批号20040610)；N,N-二甲基对甲苯胺(N,N-Dimethyl-p-toluidine)，美国Sigma公司(批号04327 MB-235)；OPG抗体，美国Abcam公司(批号GR187782-2)；RANKL抗体，美国Abcam公司(批号GR10701-10)。

1.4 仪器

2040切片机,德国Reicheit-Jung公司;FINESSE ME+全自动石蜡切片机;美国Thermo公司;Pannoramic MIDI组织切片扫描仪;匈牙利3D HISTECH公司；Pannoramic viewer与Quant center图像分析软件，匈牙利3D HISTECH公司。

1.5 分组及处理

选用健康雌性SD大鼠40只，按随机数字表法分为空白对照组10只、假手术组10只、造模组各20只。所有大鼠适应性喂养1周后，将造模组大鼠以45 mg/kg剂量的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹位固定行双侧卵巢切除术[1]。假手术组处理方法同造模组，但只切除小块脂肪组织不摘除卵巢。术后10 d，将造模组大鼠按随机数字表法分为模型组和秦皮组各10只。随后秦皮组大鼠给予秦皮水煎液(0.67 g生药/kg·d)每日1次，连续6 d，休息1 d，再连续给药6 d，如此给药3个月。空白对照组、假手术组和模型组按同法灌服等体积纯净水。

各组大鼠于处死前16 d和前3 d分别腹腔注射盐酸四环素30 mg/kg体质量，并对骨组织进行荧光标记[2]。给药结束后将大鼠处死，取左侧胫骨制作不脱钙骨切片，用于骨组织形态计量学指标的检测；取右侧胫骨制作大鼠胫骨脱钙骨的石蜡切片，用于检测大鼠胫骨骨髓中OPG和RANKL 的蛋白表达。

1.6 指标检测

骨组织形态计量学指标测定[3]：分别检测骨小梁体积百分比(TBV%)、骨小梁吸收表面百分比(TRS%)、骨小梁形成表面百分比(TFS%)、骨小梁矿化率(MAR)和类皮质平均宽度(OSW)。大鼠胫骨骨髓中OPG和RANKL的蛋白表达检测：采用免疫组化法分别检测胫骨骨髓中OPG和RANKL蛋白表达。图片经Pannoramic MIDI组织切片扫描仪扫描完成后，采用Quant center中的densito quant软件自动识别并设置组织切片上所有的深棕色为强阳性，棕黄色为中度阳性，浅黄色为弱阳性，蓝色细胞核为阴性。进而对每个组织进行识别分析出强阳性、中度阳性、弱阳性及阴性的面积(像素)和阳性的百分比，最后进行H-score评分。H-SCORE 即 histochemistry score(组织化学评分)的缩写，是处理免疫组化结果的一种组织学评分方法，将每张切片内阳性的细胞数量及其染色强度转化为相应的数值，达到对组织染色半定量的目的。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 秦皮对卵巢切除大鼠胫骨骨组织形态计量学指标的影响

表1图1显示，模型组大鼠胫骨TBV%显著低于假手术组，TRS%、TFS%、OSW和MAR均明显高于假手术组。与模型组比较，秦皮组大鼠胫骨TBV%明显增高，但仍显著低于假手术组；TRS%、TFS%、OSW和MAR均明显降低。

表1 各组大鼠胫骨骨组织形态计量学指标变化比较

注：与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较:△P<0.05，△△P<0.01

图1 各组大鼠胫骨骨小梁分布情况(甲苯胺蓝染色 ×5)

2.2 秦皮对卵巢切除大鼠胫骨骨髓中OPG、RANKL蛋白表达的影响

表2图2、3显示，与假手术组比较，模型组大鼠胫骨骨髓中OPG蛋白表达综合评分显著降低，而RANKL蛋白表达综合评分显著增高；秦皮组大鼠OPG蛋白表达综合评分显著高于模型组，而RANKL蛋白表达综合评分显著低于模型组，与假手术组比较仍有明显差异。

表2 各组大鼠OPG、RANKL蛋白表达变化比较

注：与假手术组比较:*P<0.05,**P<0.01；与模型组比较:△△P<0.01

与空白对照组比较，假手术组上述各项指标均无显著差异，从而排除了手术因素对实验的影响。

图2 各组大鼠胫骨骨髓中OPG蛋白表达比较(免疫组化染色 ×10)

图3 各组大鼠胫骨骨髓中RANKL蛋白表达比较

3 讨论

秦皮为传统中药材，在临床主要用于治疗细菌性痢疾等炎症性疾病[4-5]。《神农本草经》记载，秦皮“主风寒湿痹”。有研究表明，中药秦皮能明显降低骨关节炎关节液中的前列腺素E2(PGE2)水平[6]，而PGE2可激活破骨细胞，有很强的促进骨吸收作用。这一研究也提示，秦皮可能通过抑制PGE2水平而对骨质疏松症的防治产生影响。秦皮乙素是秦皮的主要化学成分之一，研究发现，秦皮乙素在50～100 mg/kg剂量下在体内表现出雌激素效果，秦皮乙素的弱雌激素样作用可在绝经后的治疗中发挥作用[7]；而雌激素可有效控制破骨细胞的骨吸收作用，其水平下降可导致骨质疏松症的发生。Yamada等报道，秦皮乙素通过抑制基质金属蛋白酶proMMP-1和proMMP-3合成、分泌及其活性，用于治疗骨关节炎和风湿关节炎造成的软骨损伤[8]；而基质金属蛋白酶(MMP)参与骨的重塑和构建，且表达骨吸收活性。秦皮素亦是秦皮的主要化学成分。Kuo等利用人成骨细胞MG-63细胞研究表明，在秦皮素介导的成骨细胞成熟和分化过程中，是通过促进骨形态发生蛋白-2和4(BMP-2、BMP-4)的产生来影响其分化过程[9-10]。综合上述研究结果我们推测，秦皮药材在治疗细菌性痢疾和骨关节炎等炎症性疾病之外，对于骨质疏松症亦有一定的防治作用。

本研究表明，切除大鼠卵巢3个月后，与假手术组比较，模型组衡量骨量水平的TBV%显著降低，而反映骨吸收情况的TRS%以及反映骨形成情况的TFS%、MAR和OSW则明显增加，表明切除卵巢所造成的是一种骨吸收大于骨形成的高转换型骨质疏松症动物模型，这与绝经后骨质疏松症的病理特点相一致[11-12]。给药3个月后，秦皮组的TBV%较模型组明显增加，与模型组比较，秦皮组的TRS%、TFS%、MAR和OSW均显著降低。这一结果表明，该剂量的秦皮药液对去卵巢所致的大鼠骨质疏松症具有一定的治疗作用，其对骨形成和骨吸收环节均有一定的调节作用。

RANKL是能够直接刺激破骨细胞发育并使之激活的惟一细胞因子，它与破骨细胞表面的RANK相结合，强有力地促进破骨细胞的生成、分化、成熟，并能增强破骨细胞运动能力，同时还可以抑制破骨细胞的凋亡，延长其存活时间[13]。而OPG又称为骨保护素，它可以通过与RANKL的结合，抑制破骨细胞的分化成熟，从而抑制骨吸收，减少骨量的丢失。因此，OPG/RANKL通路是非常重要的破骨细胞分化调节信号通路。本实验结果显示，模型组大鼠胫骨骨髓腔内OPG蛋白表达显著降低，而RANKL蛋白表达显著增加，这应该是模型组大鼠骨量丢失的机理之一。而秦皮药液后，大鼠的OPG和RANKL的蛋白表达均有不同程度的逆转，这说明该剂量的秦皮对OPG/RANKL破骨细胞分化通路有一定的调节作用，可以促进OPG蛋白的分泌而抑制RANKL蛋白的分泌，从而对骨代谢有一定的调节作用。综合上述实验结果可以看出，秦皮对去卵巢所致的骨质疏松症有较为明显的治疗作用。其作用途径是对OPG/RANKL破骨细胞分化通路进行调节，促进OPG蛋白的表达而抑制RANKL蛋白的表达，从而抑制过度增强的破骨细胞活性，降低卵巢切除所导致过高的骨转换率，进而防止骨量的快速丢失。