DHX9与恶性肿瘤的治疗

马娟 赵楠楠 杨拴盈

西安交通大学第二附属医院呼吸与危重症医学科710000

恶性肿瘤是严重威胁人类健康及社会发展的主要疾病。据2013年中国恶性肿瘤发病和死亡分析估计,全国2013年新发恶性肿瘤病例约368.2万例,死亡病例222.9万例,恶性肿瘤死亡率约163.83/10 万[1]。肺癌、胃癌、肝癌、结直肠癌、女性乳腺癌、食管癌是我国主要的恶性肿瘤,约占全部肿瘤新发病例的66%。肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、结直肠癌是主要的肿瘤死因,约占全部肿瘤死亡病例的70%[1]。在临床工作中,恶性肿瘤治疗仍面对着难以早期发现及诊断、抗肿瘤药物敏感性低及耐药的严峻挑战,针对新靶点的发现及靶向药物治疗的研究仍需要进一步深入。

DHX9又称为核DNA解旋酶Ⅱ或RNA 解旋酶A,主要参与RNA 代谢重要步骤,如转录、前体m RNA 剪接、翻译和核糖体生物合成[2-4],对于维持基因组的稳定性也发挥着重要作用[5]。DHX9是解旋酶DEx H-box家族的成员之一,其名源于解旋酶核心结构域中的保守序列Asp-Glu-Ile-His,也是SFⅡ类解旋酶的一部分,主要包含DEx H 解旋酶和DExD 解旋酶[5]。在线虫[6]、小鼠[7]和果蝇[8]中均发现其同源蛋白。果蝇中的DHX9突变导致雄蝇因不能蛹化而选择性死亡[9-10]。在限定温度下,蠕虫中的DHX9-1突变产生转录去沉默,导致生殖细胞增殖缺陷[6]。在原肠胚形成期间,小鼠纯合子DHX9基因突变造成早期胚胎的致死[7]。目前,在人类多种恶性肿瘤中均发现DHX9基因的突变和DHX9表达过程中的改变,表明非功能性DHX9蛋白参与恶性肿瘤的转化[11-12]。

1 DHX9与恶性肿瘤的发生、发展

1.1肺癌 Cao等[13]将正常肺组织与肺癌组织[小细胞肺癌细胞株 H446、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞株A549、PC9]的DHX9表达对比结果显示,DHX9 在肺癌的血清和组织中均存在过表达,特别是在小细胞肺癌中。且在不同临床分期的患者中：Ⅲ期或Ⅳ期肺癌患者DHX9明显高于Ⅰ或Ⅱ期肺癌患者,提示DHX9可能与肺癌的恶性程度与扩散相关。这与Wei等[14]的研究结果一致。随后通过RNA 干扰使A549 细胞株中DHX9表达下调,使用依诺沙星抑制细胞增殖,尽管依诺沙星抑制了NSCLC 细胞的增殖,但当DHX9 被敲除时其抑制作用减弱[13]。这也表明DHX9在肺癌中的过表达可能有助于肺癌的生长,依诺沙星可以有效抑制DHX9的增殖,DHX9 可以用作肺癌诊断的标志物和治疗NSCLC的潜在治疗靶点。

对77例NSCLC患者的临床表现与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)表达进行相关性研究发现癌组织中EGFR 表达显著高于正常肺组织,其中Ⅲ期NSCLC EGFR 受体表达高于于Ⅰ和Ⅱ期[15]。表明EGFR 染色高强度的存在与人类NSCLC的扩散有关,这与以上研究[13-14]中DHX9 在肺癌中的检测结果一致。而DHX9同时结合EGFR 和细胞周期蛋白启动子区富含AT的保守序列可以激活EGFR 反应性基因的转录[16],且在靶细胞中,细胞核内EGFR 表达与DHX9、cyclinD1 之间存在强烈的正相关[17]。这说明EGFR 与DHX9的相互作用与肺癌,尤其是NSCLC 的扩散密切相关。此外,DHX9 是DNA/RNA 解旋酶Schlafen-11(SLFN11)蛋白质合作伙伴,而SLFN11的沉默与增加铂化合物耐药性有关[18]。这与临床观察到携带SLFN11 高甲基化的NSCLC 患者对顺铂和卡铂治疗的反应较差的结果一致。此研究还发现SLFN11 与DHX9 发生免疫共沉淀,且细胞核中的SLFN11和DHX9蛋白存在部分共定位[18]。证实DHX9的过表达可能与NSCLC对铂化合物临床耐药性有关。

另外,通过27例肺腺癌患者的肺癌组织与其正常组织的外显子组和信使RNA(m RNA)进行测序,随后对筛选发现的序列突变及通路失调及与患者肿瘤表型及临床预后进行比较,发现DHX9突变同时发生在DNA与RNA 中,且这种高频率突变与细胞通路失调和患者生存高度相关。这也再次提示DHX9可能是肺癌治疗的新靶点[18]。DHX9能与泛素结合酶9 相互作用,使DHX9 的N 端发生泛素化[19]。泛素结合酶9过表达能促进肺癌的转移及侵袭[20],而DHX9在肺癌中过表达可能也有助于肺癌的生长,这说明DHX9与泛素结合酶9相互作用可能协同促进肺癌的扩散与转移。

1.2乳腺癌 对细胞核内EGFR 表达、DHX9、细胞周期蛋白D1在51个人乳腺肿瘤样品中的表达分析,结果发现核EGFR 的表达水平与核DHX9 表达水平强烈相关。此外,核内EGFR 和DHX9的表达与细胞周期蛋白D1的表达呈正相关。这说明核内EGFR/DHX9复合体调控癌细胞中细胞周期蛋白D1 基因的表达。由此也可以预想DHX9与EGFR 的相互作用促进乳腺癌细胞的增殖。目前针对EGFR 的疗法,包括吉非替尼、西妥昔单抗、拉帕替尼等在乳腺癌中的临床效果欠佳。DHX9能否作为乳腺癌治疗的潜在靶点还需进一步深入研究[17]。

另外,Schlegel等[21]利用显性负性方法来阻断人乳腺上皮细胞中的BRCA1功能并鉴定出BRCA1功能丧失后人乳腺上皮细胞发生的变化。研究结果显示发现在人乳腺上皮细胞株MCF-10A 中,观察到DN-RHA 的过表达导致MCF-10A 细胞中四倍体的出现(与乳腺癌早期病变一致)。这说明DHX9高表达可能与早期乳腺癌的发生密切相关。对来自高风险但BRCA1/BRCA2表达阴性的法国、加拿大家庭的96例乳腺癌个体队列中的BRCA1相互作用蛋白的基因进行检测发现DHX9基因序列的突变[11]。DHX9可使BCRA1转录减少以促进乳腺癌的发生[22]。

1.3尤文肉瘤(Ewing sarcoma,ES) 85%的ES 中存在EWS-FLI1[23]。通过研究EWS-FLI1 对RHA 解旋酶活性的影响,发现EWS-FLI1 以剂量依赖性方式降低RHA解旋酶活性而不影响内源性ATP 酶活动;YK-4-279 抑制RHA 与EWS-FLI1结合并且改变了2种蛋白的RNA 结合特征;而使用YK-4-279的对映异构体[YK-4-279(S)],可以逆转这种抑制作用。从而得出结论,EWS-FLI1 调节RHA 解旋酶活性,导致整体转录组加工的变化[24]。此结果与其他研究结果一致[25],所以DHX9 与致癌转录因子EWS-FLI1相互作用促进ES发生。

Fidaleo等[26]发现紫外线照射可以诱导DHX9 亚型的产生,从而导致前体m RNA 的选择性剪接,进而造成DHX9蛋白的低表达;DHX9 蛋白与RNA 聚合酶Ⅱ和EWS-FLI1形成复合物以增强转录。ES细胞中DHX9的沉默使它们对紫外线处理敏感并且影响EWS-FLI1募集到靶基因,而DHX9过表达保护ES 细胞免受基因毒性应激。证实DHX9与EWS-FLI1相互作用,造成ES的发生,抑制DHX9可能为ES的治疗提供新的方法和前景。

1.4膀胱癌 人类DHX9 基因定位于前列腺癌的主要易感性位点染色体带1q25[27],DHX9表达受转录因子SOX4控制,SOX4在前列腺癌中过表达[28]。SOX4 与抑制性蛋白质相互作用,导致DHX9 表达降低[29]。SOX4 还调节RNA 诱导沉默复合体中Dicer和Argonaute蛋白的转录,两者都与DHX9相互作用[28-30],事实上,DICER 本身在前列腺癌中过表达[31]。这些研究表明,DHX9可能在前列腺癌发展中发挥作用,但需要进一步验证其直接联系。

1.5淋巴瘤 DHX9抑制通过激活p53信号引发凋亡或衰老反应。但也研究显示DHX9 抑制也可能在缺乏功能性p53的细胞中具有有害作用。DHX9的缺失导致p53 缺陷小鼠淋巴瘤细胞死亡增加,并且p53缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞中的G0/G1细胞周期停滞。对p53 转录靶标的m RNA 水平的分析表明p53缺失型淋巴瘤尽管没有功能性p53,p53靶标子集也被激活。这意味着在p53 缺陷细胞中,DHX9通过旁路途径介导细胞死亡和细胞周期停滞,并支持在p53缺陷肿瘤中靶向DHX9治疗的可行性[32]。此外在另一研究中指出无论在体内还是体外情况下,抑制DHX9的表达均对Tsc2+/Eu-Myc淋巴瘤细胞具有致死作用,且可以在体内延长淋巴瘤的形成时间[33]。

1.6结直肠癌 在携带鼠科CT26结肠癌肝转移的小鼠中筛选了一个大核酸酶RNA 寡核苷酸文库,以鉴定可定位于肝内肿瘤沉积物的RNA 适体。结果发现其中一种适体S-1与蛋白质DHX9 特异性结合,且S-1 优先定位于体内癌细胞的细胞核,而DHX9是已知在结肠直肠癌中上调的RNA 解旋酶,因此具有靶向治疗的潜力[34]。

1.7神经母细胞瘤 在神经母细胞瘤中,驱动蛋白家族成员1Bβ(kinesin family member1B isoform b,KIF1Bβ)与DHX9相互作用,引起DHX9的核积累,随后诱导促凋亡XIAP相关因子1,继而诱导凋亡。在缺乏神经生长因子的细胞凋亡过程,DHX9诱导是必需的。染色体1p36缺失的神经母细胞瘤同时表现出KIF1Bβ表达缺失和DHX9核定位的受损,暗示神经母细胞瘤发病机制与DHX9核活性的丧失有关。KIF1Bβ具有神经母细胞瘤肿瘤抑制特性并可通过激活促凋亡XIAP 相关因子1表达得到增强,而这需要DHX9的诱导凋亡来实现。KIF1Bβ的缺失改变DHX9 的亚细胞定位并减少交感神经元的神经生长因子依赖性,导致神经母细胞的剔除减少,因此可能易于形成肿瘤。有趣的是,在神经母细胞瘤中,DHX9 可能作为保护性因子。这可能与细胞所处的微环境有关,具体机制还有待进一步研究[35]。

1.8其他 DHX9 也涉及骨肉瘤和Wilms肿瘤。骨肉瘤细胞系的基因表达谱显示出DHX9 的过表达,核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)途径中的几个其他基因也被上调。由于DHX9是一种NF-κB的分子伴侣,这支持NF-κB信号转导在骨肉瘤转移中的作用[36]。DHX9 与miRNA miR-483-5p协同作用诱导胰岛素样生长因子2 的表达。在Wilms肿瘤和骨肉瘤中miR-483-5p和IGF 都过表达,且在肉瘤细胞和小鼠异种移植细胞中miR-483-5p的异位表达增强了肿瘤发生[37]。另外,DHX9在宫颈癌的发生中也存在重要的作用。lnc-CCDST 的长非编码RNA 在宫颈癌组织中显著下调,而DHX9在宫颈癌组织中上调,并促进宫颈癌细胞转移和血管生成[38]。lnc-CCDST 和DHX9通过泛素蛋白酶体途径(E3泛素连接酶MDM2)相互作用促进DHX9降解。人乳头瘤病毒癌基因E6和E7消除了lnc-CCDST 的表达,破坏MDM2 和DHX9 相互作用以及DHX9降解,导致DHX9的增加,从而促进宫颈癌细胞的转移和血管生成,并鉴定其可以作为人乳头瘤病毒恶性肿瘤的潜在治疗靶标。

2 DHX9与恶性肿瘤治疗

ABT-737是B淋巴细胞瘤基因2、B淋巴细胞瘤基因-XL的有效抑制剂[39-40]。使用Arf-/-Eμ-myc/Bcl-2小鼠淋巴瘤细胞(其过度表达外源BCL-2并且对ABT-737有抗性),在利用sh RNA 筛选ABT-737的致敏剂时,发现DHX9作为合成致死剂被击中。DHX9 抑制通过激活p53,克服了对ABT-737的抗性,最终导致细胞凋亡[41]。因此DHX9可能是抑制ABT-737或其衍生物的候选靶点。在人类多发性骨髓瘤细胞株中,敲除DHX9出现协同增强糖皮质激素地塞米松对骨髓瘤的治疗作用[33,42],表明在多发性骨髓瘤中针对DHX9靶向治疗的可能性。在来源于不同类型癌症(包括多发性骨髓瘤、骨肉瘤、乳腺癌、肺癌和宫颈癌)的人类细胞株中,抑制DHX9 可使大多数以上细胞株致死[33]。在MYC驱动的小鼠淋巴瘤模型中,发现无论在体内或者体外抑制DHX9均对淋巴瘤细胞具有致死作用,并延长携带这些肿瘤的小鼠的存活时间;在ES家族肿瘤中,将EWS的5'反式激活结构域与转录因子FLI1的3'ETS结构域融合,得到融合蛋白EWS-FLI1,EWS-FLI1具有致癌性[43]。在异体移植模型中,阻断DHX9和EWS-FLI1之间相互作用的小分子(YK-4-279)则会诱导ESFT 细胞凋亡并抑制肿瘤生长。YK-4-279活性已通过药代动力学研究进行了优化,并开发了口服可用制剂,因此有希望成为临床开发的候选药物[44-45]。已经证明,虽然DHX9的丧失在各种人类和小鼠癌细胞中具有致死性,但是在一定条件下的小鼠模型中DHX9抑制在生物水平上可以良好耐受,且携带低水平DHX9的小鼠并未表现出明显的不良反应,甚至在高度增殖的组织如皮肤或肠中也是如此[41]。因此,有理由推断DHX9抑制在正常组织中可以耐受,DHX9可能作为恶性肿瘤治疗的潜在新靶点。但目前靶向作用于DHX9的药物仍处于基础研究,尚需要更多的临床试验及数据验证其有效性及安全性。

3 结论与思考

近年来,随着精准医学的不断发展,人类对肿瘤的认识不断深入,明确基因型与表型的关联,精确寻找疾病的原因和治疗靶点,根据分子亚型将治疗靶点与特定的靶向药物精准配对,从而实现肿瘤个体化治疗[46]。而临床中肿瘤靶向药物耐药普遍存在,目前仍需要更多的研究以制定针对其耐药可选用的临床新策略。研究表明DHX9与乳腺癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生密切相关,可能成为恶性肿瘤治疗的新靶点。

DHX9在DNA复制、转录、翻译,RNA 加工及转录,维持基因稳定性等方面具有重要的调控作用。在多种人恶性肿瘤中均存在DHX9的过表达,抑制DHX9会对大多数肿瘤细胞具有致死性,但在肿瘤细胞和正常组织中,DHX9抑制的不同作用及机制仍不清楚,可能与DHX9对肿瘤细胞的更高依赖性有关。鉴于DHX9在DNA/RNA 复制、转录、翻译、维持基因稳定性过程均有重要的作用,而肿瘤细胞中上述过程大多失调,那么肿瘤细胞对DHX9是否具有“依赖性”也值得深思及进一步深入研究。另外,在神经母细胞瘤中,DHX9可能抑制肿瘤的发生,这暗示DHX9的作用可能与细胞所处的微环境及相互作用的分子伴侣活性相关。在人体中,DHX9抑制剂又是否存在“脱靶”及对机体不良反应的大小还有待进一步的大量多中心临床试验验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突