中华羊茅内生真菌共生体对多年生黑麦草种子萌发和幼苗生长的影响

2019-03-16李苗苗古丽君马碧花王美宁蔺伟虎许文博

草原与草坪 2019年1期

李苗苗，古丽君，马碧花，王美宁，蔺伟虎，许文博，旷宇，田沛

(兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室/兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室/兰州大学草地农业科技学院，甘肃兰州 730020)

自然界中大多数陆生植物都可与微生物形成互利共生或内寄生关系，禾草内生真菌是广为关注和研究的内生真菌之一[1-3]。禾草内生真菌是指在禾草体内度过全部或大部分生活周期,而宿主不显示任何外部症状的一大类真菌[4-5]。目前，对禾草内生真菌的研究主要集中在广泛分布于冷季型禾草中的香柱菌(Epichloё)属及其无性态Neotyphodium属，内生真菌因具有提高群落竞争性、增强宿主抗逆性等优点而受到越来越多的关注。禾草和内生真菌之间存在互惠共生关系，主要表现在禾草能够为内生真菌的生长提供碳源和矿物质，而内生真菌不仅能够促进禾草的生长，提高对不良环境的抵抗能力、还能减少食草动物采食等，从而提高宿主生态适应性，增强种群竞争力[6-7]。禾草内生真菌共生体的研究包括内生真菌对宿主生长的影响[8-11]；对盐胁迫、干旱、病虫害、重金属等逆境下宿主抗逆性的影响[12-18]；对禾草内生真菌的分离鉴定及对毒性的改良[19-20]；以及对共生体进化过程和途径的探索等方面[21]。

多年生黑麦草(Loliumperenne)为禾本科(Poaceae)黑麦草属多年生疏丛型草本植物，是世界范围内一种重要的冷季型草坪草[22]，生长快、分蘖多、繁殖力强、品质好、再生性强、质地柔软、株型外观优美，是草坪建植的良好品种。它原产北非、西南欧和亚洲西南的温带地区，现广泛分布于各温带地区[23]。

化感作用(Allelopathy)是指植物通过向自身所处的外界环境中释放某些化学物质(化感物质)进而对周围环境中的其他植物或微生物产生有利或不利影响，从而使植物在生长竞争中处于有利地位，获得生长优势。目前，有关内生真菌化感作用的研究报道，主要集中于多年生黑麦草[24-26]和高羊茅(Festucaarundinacea)[27-28]，研究表明内生真菌的浸染可以提高宿主植物的化感作用。中华羊茅(Festucasinensis)的叶较纤细，茎部为紫色，根为须根。其分蘖能力强，叶量丰富且枯黄时间晚，产量较为稳定，有较强的适应性。但中华羊茅单播时，常因杂草丛生而影响其产量，因此，多与其他牧草伴生时产量更佳。为探究其化感作用，以未浸染内生真菌的多年生黑麦草为材料，研究中华羊茅带菌(E+)和不带菌(E-)草粉对多年生黑麦草种子萌发的影响，为同一生境内生真菌共生体与黑麦草的生长提供理论依据，以期为中华羊茅内生真菌的开发和利用提供一定的科学依据。

1 材料和方法

1.1 材料

于2017年8月在兰州大学草地农业科技学院试验地采集已生长3年的6个不同地理种群的中华羊茅被内生真菌侵染的(E+)与未侵染的(E-)植株地上部分(离地面1 cm收集样品)，用剪刀将离地面1 cm整株植物剪下后分别置于15 mL离心管中，放于液氮罐中带回实验室，经冷冻干燥机低温干燥48 h/-80℃(Labconco FreeZone Plus 6 L，LBC#7934030，美国)，后用组织研磨仪研磨(RETSCH MM400，25frqucey/1 min)，过2 mm筛，将研磨后的草粉装入3号自封袋中，4℃保存备用(表1)。

1.2 供试种子

两种不同品种的多年生黑麦草种子Venus和Esquire，购于百绿公司。经苯胺蓝检测法[8]，对种子进行内生真菌检测，检测结果为均不带内生真菌。

1.3 试验方法

灭菌的培养皿(直径9 cm)中分别加入E+和E-中华羊茅草粉1 g[24]，摇匀后盖上2层灭菌的滤纸，加入10 mL蒸馏水，浸泡24 h。分别选取大小均匀，饱满的多年生黑麦草种子用5%次氯酸钠消毒5 min，再用无菌水冲洗3次，继续用75%酒精消毒3 min，再用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸将种子表面的水分吸干后均匀的摆放于含有灭菌滤纸的9 cm培养皿中，每皿放置50粒种子，以不加中华羊茅草粉，只放灭菌滤纸为对照。用封口膜(4″×125FT/Roll)密封，试验共设置26个处理，每个处理4个重复。将培养皿置于人工变温光照培养箱(温度25℃/15℃日/夜；光周期为16 h/8 h光/暗;光照度5 000 lx)，胚根长度超过2 mm视为发芽，每天记录发芽的种子数，第5 d进行种子发芽势的测定，12 d后计算最终发芽率。21 d后每个重复随机选取10株幼苗，测定其鲜重、干重、胚根长和胚芽长，并计算发芽率、活力指数、发芽指数、胚根胚芽比、幼苗含水量。指标计算方法参照文献[25]的方法进行。

表1 不同地理种群中华羊茅

1.4 数据处理

试验所有数据用Microsoft Excel 2010录入并作图。各指标用SPSS 19.0分析软件进行单因素方差分析、独立样本t检验和Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 中华羊茅草粉对多年生黑麦草种子萌发特性的影响

2.1.1 发芽率和发芽势与对照相比，不同地理种群中华羊茅草粉均抑制了多年生黑麦草种子萌发，但抑制作用不尽相同。对Venus，E+种群处理的样品中仅有99和141两个种群处理的黑麦草种子的发芽率显著低于对照(P<0.05)，而E-种群处理的样品中，41、99、111和141种群处理的黑麦草种子的发芽率显著低于对照(P<0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire的抑制作用较弱，6个种群处理下，仅有99一个种群的E+和E-处理的黑麦草种子发芽率显著低于对照(P<0.05)。而在同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Esquire，只有41处理的种子E+发芽率(83.33%)显著高于E-的发芽率(P<0.05)，其他5个地理种群间无显著差异。而对品种Esquire，E+和E-中华羊茅草粉之间均无显著差异(图1)。

图1 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的发芽率Fig.1 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination rate of perennial ryegrass注：大写字母表示带菌(E+) ,小写字母表示不带菌(E-) 的不同地理种群中华羊茅草粉对多年生黑麦草种子萌发之间差异显著(P<0.05)；*表示同一地理种群中华羊茅带菌(E+)和不带菌(E-)之间具有差异显著(P<0.05)，下同

多年生黑麦草种子发芽势受到中华羊茅草粉E+和E-的影响。对品种Venus，E+种群处理的样品中，41、99、111和141种群处理的黑麦草种子的发芽势显著低于对照(P<0.05)，而E-种群处理的黑麦草种子发芽势均显著低于对照(P<0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire表现为E+种群中41、84、99和141种群处理的黑麦草种子的发芽势显著低于对照(P<0.05)，E-中均仅有41和99两个种群处理的黑麦草种子发芽势显著低于对照(P<0.05)。而同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Venus，E+和E-中华羊茅草粉均无显著差异。对品种Esquire，只有种群84和141的E+处理的黑麦草种子的发芽势显著低于E-处理的黑麦草种子的发芽势(P<0.05)，其它4个地理种群间无显著差异(图2)。

图2 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的发芽势Fig.2 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination energy of perennial ryegrass

2.1.2 发芽指数和活力指数 Venus和Esquire的发芽指数随着不同地理种群中华羊茅草粉的变化而变化(图3)。对品种Venus，E+种群处理的样品中，41、99、111和141种群处理的种子发芽指数显著低于对照(P<0.05)，而E-种群处理的样品种子发芽指数均显著低于对照(P<0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire表现为E+种群中41和99种群处理的黑麦草种子发芽指数显著低于对照(P<0.05)，E-中均仅有99一个种群处理的黑麦草种子的发芽指数显著低于对照(P<0.05)。而同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Venus，只有57的E+处理的黑麦草种子发芽指数(66.9%)显著高于E-处理的黑麦草种子发芽率(P<0.05)，其他5个地理种群间无显著差异。而对品种Esquire，种群84 E+处理的黑麦草种子的发芽指数显著低于E-处理的黑麦草种子的发芽指数(P<0.01)，种群141 E+处理的黑麦草种子发芽指数显著高于E-发芽指数(P<0.05)，其他几个地理种群间差异不显著。

图3 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的发芽指数Fig.3 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on germination index of perennial ryegrass

在不同地理种群中华羊茅草粉处理下，多年生黑麦草的种子活力指数不同。品种Venus E+种群处理的样品中，41、84、99、111和141种群处理的黑麦草种子的种子活力指数显著低于对照(P<0.05)，而E-种群处理的样品中，41、57、99、111和141地理种群处理的黑麦草种子的种子活力指数均显著的低于对照(P<0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire表现为E+和E-种群中仅有99一个种群处理的黑麦草种子的种子活力指数显著低于对照(P<0.05)，其他5个地理种群处理的黑麦草种子的种子活力指数与对照相比没有显著差异性。而同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Venus，只有种群57和111处理的黑麦草种子E+种子活力指数显著高于E-的种子活力指数，其他4个地理种群间无显著差异。而对品种Esquire，仅有种群99E+和E-中华羊茅草粉之间有显著差异(P<0.05)(图4)。

图4 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的活力指数Fig.4 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on seed vigor index of perennial ryegrass

2.2 中华羊茅草粉对多年生黑麦草幼苗生长的影响

2.2.1 胚芽长和胚根长不同地理种群中华羊茅内生真菌共生体对多年生黑麦草胚芽的生长的作用不同。对品种Venus，E+种群处理的样品中，84，111和141种群处理的黑麦草种子胚芽长显著高于对照(P<0.05)，而E-种群中6个地理种群处理的黑麦草种子胚芽长与对照相比没有显著差异(P>0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire表现为E+种群中仅有57，111两个种群处理的黑麦草种子胚芽长显著高于对照(P<0.05)，而E-种群处理的样品中，57、111和141的胚芽长显著高于对照(P<0.05)。而同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Venus，只有种群141处理的黑麦草种子E+胚芽长显著高于E-的胚芽长(P<0.05)，其他5个地理种群间无显著差异。而对品种Esquire，E+和E-中华羊茅草粉之间均无显著差异(图5)。

图5 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的胚芽长Fig.5 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on plumule length of perennial ryegrass

多年生黑麦草的胚根长受中华羊茅带菌(E+)和不带菌(E-)的影响。不同地理种群中华羊茅草粉处理品种Venus，E+种群处理的样品中，41、84、99、111和141种群处理的黑麦草种子胚根显著低于对照(P<0.05)，而E-种群中6个地理种群处理的黑麦草种子胚根长均显著的低于对照(P<0.05)。Esquire经中华羊茅草粉处理，6个地理种群处理的黑麦草种子E+胚根长均显著高于对照的胚根长(P<0.05)，而E-种群除41处理的黑麦草种子外，其他5个地理种群处理的黑麦草种子胚根长均显著高于对照(P<0.05)。而同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，对品种Venus，只有种群5处理的黑麦草种子的E+胚根长显著高于E-的胚根长(P<0.05)，其他5个地理种群间无显著差异。而对品种Esquire，E+和E-中华羊茅草粉之间均无显著差异(图6)。

图6 不同地理种群中华羊茅草粉处理下多年生黑麦草种子的胚根长Fig.6 Effect of extracts of different ecotypes F.sinensis on radicle length of perennial ryegrass

2.2.2 幼苗总生物量不同地理种群中华羊茅草粉处理对多年生黑麦草幼苗的总生物量也产生不同程度的影响。对Venus，E+种群处理的样品中99总生物量最大，各地理种群与对照相比差异不显著(P>0.05)，而E-种群处理的样品中，141总生物量最大，各地理种群与对照相比差异不显著(P>0.05)。而中华羊茅草粉对品种Esquire，E+和E-种群处理的样品，对照(CK)组的总生物量为0.003 8 g，与处理组差异不显著(P>0.05)。而在同一地理种群的E+和E-中华羊茅草粉处理下，6个地理种群处理的黑麦草品种Venus的种子均无显著差异(P>0.05)。仅有种群41E+处理的黑麦草品种Esquire的种子的总生物量显著低于E-的总生物量(P<0.05)，其他5个地理种群间无显著差异(P>0.05)(表2)。

2.2.3 不同地理种群中华羊茅草粉对2种多年生黑麦草几项生长指标影响的相关性分析在不同地理种群中华羊茅草粉处理下，多年生黑麦草的生长指标间的相关性不同。Venus的胚芽长与胚根长呈显著正相关(P<0.05)，与鲜重呈极显著正相关(P<0.01)，胚根长与根芽比呈极显著正相关(P<0.01)，Esquire的胚芽长与鲜重呈显著正相关(P<0.05)(表3)。

表2 中华羊茅草粉处理下2种多年生黑麦草幼苗的总生物量

注：不同字母表示同一品种不同地理种群处理间差异显著(P>0.05)

3 讨论

种子和幼苗是植物生活史必经的重要阶段，其生长发育受生物和非生物胁迫的影响更为明显，对环境的适应能力直接的体现物种的竞争能力、分布范围和丰富程度[21]。并且种子和幼苗也是植物生活史的薄弱环节，是建植的关键时期。试验以不同地理种群带菌(E+)和不带菌(E-)的中华羊茅草粉为材料，研究了不同地理种群E+和E-中华羊茅草粉对多年生黑麦草种子萌发的影响，以模拟田间自然条件下中华羊茅生长对多年生黑麦草的作用，结果表明中华羊茅草粉对多年生黑麦草的萌发具有一定的抑制作用。

Venus与对照相比，E+种群99和141处理的样品对多年生黑麦草种子发芽率有抑制作用，E+种群41、99、111和141处理的样品对多年生黑麦草种子发芽势、种子活力指数、发芽指数和胚根长具有抑制作用；对Esquire，E+种群99处理的样品对多年生黑麦草种子发芽率和活力指数具有抑制作用，E+种群41和99处理的样品均对多年生黑麦草种子发芽势和发芽指数有抑制作用。研究表明，2种不同生态型受Neotyphodiumlolii侵染的多年生黑麦草其产生的生物碱含量不同[27]。内生真菌产生的次生代谢物参与了植物的化感作用中，对多年生黑麦草的生长产生了抑制作用。不同种群的中华羊茅生态型具有明显的差异性，且禾草内生真菌与不同生态型和生境的相互作用也对周围共生植物有显著的影响。Venus与对照相比，E-的6个种群均对其发芽势，发芽指数和胚根长具有抑制作用；Esquire，E-种群99处理的样品对多年生黑麦草种子发芽率、发芽指数、发芽势和种子活力指数均具有抑制作用。这与黄玺等[28]在不带菌醉马草提取液浓度为0.20 g/mL条件下对针茅(Stipacapillata)和硬质早熟禾(Poasphondylodes)幼苗生长具有显著抑制作用的结果相一致。与E-相比，E+种群除41外，其他5个地理种群均对黑麦草的胚根长具有促进作用，与南志标等[8]研究的内生真菌可显著促进布顿大麦草生长的结果相似。Venus和Esquire的胚芽长与鲜重均呈显著正相关。与E-相比，种群41E+中华羊茅草粉显著抑制了Esquire品种的总生物量(P<0.05)。这与Prestidge[28]研究发现E+多年生黑苗草水浸提液抑制白三叶根长和苗长的结果一致。Springer[27]的研究也证明了E+高羊茅对三叶草生长的抑制作用强于E-。