外周血单核细胞趋化蛋白-1水平及基因多态性与糖尿病肾病的关系

王 芸 李 侠 郭殿选

(江苏省淮安市第二人民医院暨徐州医科大学附属淮安医院老年病科，淮安市 223002，电子邮箱：wyun1105@126.com)

目前，糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)已成为糖尿病患者出现终末期肾病的重要原因，也是导致糖尿病患者死亡的主要原因[1]。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)主要由内皮细胞、血管平滑肌细胞及单核/巨噬细胞分泌。在糖尿病发展过程中，MCP-1可趋化血液循环中的单核细胞进入肾组织，并在肾小球基底膜下活化成巨噬细胞；而巨噬细胞通过结合相关受体趋化因子受体2，激活相应的信号通路，诱导不同细胞因子和生长因子的分泌，从而促进了上皮细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞的增殖，引起细胞外基质堆积和基底膜增厚，进而导致肾间质纤维化和肾小球硬化的发生[2-3]，最终引起DN。已有研究表明MCP-1基因的转录起始位点-2518存在A/G多态性，并且该多态性与MCP-1的转录及表达相关[4]，这可能与DN的发病有关。因此，为了进一步探讨MCP-1与DN的关系，本研究对比DN患者、非DN糖尿病患者、健康体检者MCP-1基因转录起始位点-2518A/G的多态性及MCP-1的血清水平。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年2～10月期间在我院住院治疗的112例2型糖尿病患者为研究对象。2型糖尿病的诊断参照1999年世界卫生组织制定的标准[5]：(1)有糖尿病症状，并且随机(餐后任何时间)血糖≥11.1 mmol/L；(2)FBG(禁食至少8 h)≥7.0 mmol/L；(3)OGTT后2 h血糖≥11.1 mmol/L；符合上述标准中的一项或多项者即可诊断为糖尿病。排除原发性肾病者、其他非糖尿病因素引起的继发性肾病者、严重高血压者、近段时间发生过糖尿病急性并发症者。根据24 h尿白蛋白排泄率及血清肌酐，将2型糖尿病患者分为两组：(1)糖尿病组共52例，其24 h尿白蛋白排泄率≤30 mg/24 h及血清肌酐≤133 μmol/L；(2)DN组共60例，其24 h尿白蛋白排泄率>300 mg/24 h或血清肌酐>133 μmol/L。另外选择78例健康体检者作为正常对照组，均排除感染、心血管疾病、糖尿病及相应疾病家族史。3组间年龄、性别、FBG、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)等比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表1。

表1 3组的一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 标本采集：所有受试者均隔夜空腹8 h以上，于次晨空腹经肘正中静脉取血5 ml，用乙二胺四乙酸抗凝，其中2 ml保存在-20℃冷柜，用于提取DNA；另外3 ml血标本在室温(20℃～25℃)下放置60 min，1 000 r/min，离心15 min后，留取上清液置于-80℃保存待测，用于测定血清MCP-1水平。

1.2.2 MCP-1基因多态性的检测：(1)按照全血DNA提取试剂盒(北京百奥森泰生物技术有限公司，生产批号：Lot B130200)的步骤提取DNA，置于-20℃冷柜保存。(2)利用等位基因特异性扩增技术，根据相关文献[6]的方法合成序列，其中上游引物为5′-CCGAGATGTTCCCAGCACAG-3′，下游引物为5′-CTGCTTTGCTTGTGCCTCTT-3′，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。 按照实时荧光PCR试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司，生产批号：B639297)的说明书进行PCR反应。PCR的反应条件为：94℃预变性5 min；93℃变性50 s，56℃退火40 s，72℃延伸1 min，共35个循环；最后70℃延伸10 min。(3)取PCR扩增产物进行酶切电泳鉴定。10 μl扩增产物中加入1 μl的限制性内切酶PvuⅡ，2 μl的10×FastDigest缓冲液，17 μl去离子水，混匀后放入37℃水浴酶切5 h。酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后将凝胶置于紫外灯下进行观察分析。根据MCP-1基因经内切酶PvuⅡ酶切片段的情况，基因型分为3种(见图1)：AA纯合子无酶切点，仅显示1个片段(930 bp，条带3)；GG纯合子可完全酶切为两种片段(708 bp、222 bp，条带2、4)，AG杂合子可酶切为3种片段(930 bp、708 bp、222 bp，条带1、5、6)。

图1 MCP-1基因转录起始位点-2518产物PvuⅡ酶切电泳示意图

1.2.3 血清MCP-1水平的测定：用酶联免疫吸附法测定血标本MCP-1水平。试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司(生产批号：C547421-0048)，严格按说明书进行测定。

1.3 统计学分析 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或方差分析；计数资料以例数(百分比)表示，组间比较采用χ2检验。采用Hardy-Weinberg平衡检验分析研究样本的群体代表性。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组MCP-1基因型和等位基因频率分布情况 MCP-1基因型频率在正常对照组中的分布符合遗传平衡定律(均P>0.05)，见表2。3组间MCP-1基因型和等位基因频率分布比较，差异均有统计学意义(均P<0.05)，其中，DN组的GG基因型及G等位基因频率均高于糖尿病组、正常对照组(均P<0.05)，而糖尿病组与正常对照组间MCP-1基因型和等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表3。

表2 MCP-1基因型在各组中的Hard-Weinberg平衡检验[n(%)]

表3 3组MCP-1基因型和等位基因频率分布比较[n(%)]

2.2 3组不同基因型研究对象血清MCP-1水平 在不同基因型研究对象中，正常对照组、糖尿病组、DN组MCP-1的血清水平均依次升高(均P<0.05)；而在同一组中，3种基因型研究对象的血清MCP-1水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表4。

表4 3组不同基因亚型研究对象血清MCP-1水平(x±s，pg/ml)

注：与正常对照组比较，*P<0.05；与糖尿病组比较，#P<0.05。

3 讨 论

DN作为糖尿病的并发症之一，严重影响糖尿病患者的预后，目前认为其基本的病理改变主要为细胞外基质过度积累、基底膜增厚、肾小球系膜基质增加、弥漫性和结节性肾小球硬化、间质纤维化和足突融合[7-8]。MCP-1在单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、血管及平滑肌细胞上均可表达[9]。在DN的发展过程中，肾小管上皮细胞产生的MCP-1可直接引起肾小管周围大量巨噬细胞、成纤维细胞的募集，造成小管受损，从而加重肾损伤[9]。在DN早期，MCP-1可通过引起肾小球巨噬细胞的广泛浸润，诱导肾纤维化的发生；随后MCP-1可通过直接与肾小球基底膜细胞上的趋化因子受体2结合引起纤维化反应，同时可刺激肾小球基底膜细胞过度表达转化生长因子-β1，促进成纤维细胞细胞外基质的合成，进一步加速DN患者的肾脏纤维化进程[10]。另有研究表明，MCP-1 mRNA及蛋白质的表达与肾损害的程度呈正相关[11]。本研究结果显示，无论为何种基因型，正常对照组、糖尿病组、DN组研究对象的血清MCP-1水平均依次升高(均P<0.05)。结合MCP-1在诱导肾脏纤维化的作用，我们推测MCP-1广泛参与了DN的发生发展过程。

单核苷酸多态性是人类DNA序列中最常见的变异形式，此领域的研究是探讨基因与疾病关系的重要途径。MCP-1基因启动子区域的-2518位点存在单核苷酸多态性位点，包含3种基因型：纯合子AA、突变型纯合子GG以及杂合子AG[9]。本研究结果显示，DN组患者MCP-1基因-2518位点的GG基因型及G等位基因频率均高于糖尿病组和正常对照组(P<0.05)，但糖尿病组、正常对照组间MCP-1基因型和等位基因频率分布比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)，提示MCP-1基因-2518位点的多态性可能与DN的发生相关，G等位基因可能会增加DN的发病风险。Raina等[12]的研究结果表明MCP-1基因-2518位点GG基因型可能增加DN进展到终末期肾病的风险；Mao等[13]研究发现MCP-1基因-2518位点的G等位基因可能是亚洲人尤其是印度人发生DN的危险因素。但国外也有学者发现，A等位基因可能是2型糖尿病进展的独立危险因素，其与肾功能衰竭存在显著相关性[14-15]。因此，关于MCP-1基因-2518位点多态性与DN关系仍存在争议，究其原因可能与研究对象来自不同国家、种族，其MCP-1基因型的分布频率在不同人群分布差异较大有关。

本研究结果还显示，各组不同基因亚型人群间的血清MCP-1水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。有研究结果显示，MCP-1基因的多态性对其转录活性存在影响，其中含G等位基因者MCP-1表达水平更高[16]，但我们并未观测到相似结果，这可能与本研究纳入的研究对象不同有关。另外，本研究样本量较小，所得结论的论证强度较弱，仍需要进行多中心、大样本的病例对照研究来证实结论的可靠性。

综上所述，MCP-1可能参与了DN的发生发展过程；MCP-1基因的多态性可能与DN的发生有关，其中G等位基因可能是2型糖尿病患者发生DN的易感基因。但由于DN是多基因遗传性疾病，其遗传易感性模式至今尚不清楚，仍需要更深入的研究来进一步分析MCP-1基因多态性及血清水平在DN进展过程中的作用。