CD2相关蛋白在肾脏疾病中的作用机制及相关研究进展▲

2019-03-20梁勇华刘运广罗秀状

广西医学 2019年3期

梁勇华刘运广罗秀状

(1 右江民族医学院研究生院，广西百色市 533000，电子邮箱：710304325@qq.com；2 右江民族医学院附属医院儿科，广西百色市 533000)

【提要】 CD2相关蛋白(CD2AP)是由CD2AP基因编码产生的一种足细胞裂孔隔膜分子，是肾小球滤过屏障形成的重要蛋白分子，其在维持足细胞结构形态以及生理功能中起至关重要的作用，多种肾脏疾病的发生与CD2AP表达密切相关。本文就近年来CD2AP的结构分布、与肾脏疾病的关系及相关分子机制进行综述。

CD2相关蛋白(CD2 associated protein，CD2AP)主要在肾脏的肾小球足细胞裂孔隔膜上表达，是保持肾小球滤过屏障生理完整性的重要组成成分[1]。CD2AP表达量的减少及结构的变化可引起足细胞裂孔隔膜分子(slit diaphragm，SD)结构的改变，并出现足细胞融合、足细胞从肾小球基底膜脱落，而成熟的足细胞没有增殖能力，其发生损伤可能导致持续性不可逆性蛋白尿[2]，并逐渐出现肾功能衰竭甚至死亡[3-5]。有研究显示，嘌呤霉素肾损害的小鼠足细胞CD2AP mRNA及其蛋白的表达量低于正常小鼠，提示CD2AP在肾病的发生中有重要的作用，而其具体作用机制目前尚未完全阐明。本文就CD2AP的结构分布、与肾脏疾病的关系及相关分子机制进行综述。

1 CD2AP蛋白的结构及分布

CD2AP蛋白是由位于6p12染色体上的CD2AP基因编码，其编码区长为1920 bp，含有18个外显子，由639个氨基酸组成，分子量约为70 kDa，其含有特殊的SH3结构，在维持正常肾功能所需的细胞与细胞结合中发挥重要作用[6-7]。电子密度图分析表明，CD2AP蛋白中央由卷曲螺旋结构域组成，形成四聚体的界面，周围有四个对称相关的图案，每个图案包含三个球状结构域对应三个SH3结构域[8-10]，该结构域由3个Src同源结构域组成，链接在CD2AP的N端，为一个高度保守的结构域，但其氨基酸组成在少数几个关键位点上存在差异，具有广泛的分子靶点，能够与分化抗原簇2(cluster of differentiation 2，CD2)、ALG-2相互作用蛋白X(ALG-2-interacting protein X，ALIX)、泛素连接酶(Casitas B-lineage lymphoma，c-Cbl)和泛素相互作用，具有分子识别和结合受体的功能；C端为一种螺旋式(亮氨酸-拉链)结构域[11-13]。CD2AP的这种特殊构成是其能使足细胞与不同分子之间发生相互作用并参与肾病发生的基础。

CD2AP是由Dustin等[14]在小鼠身上发现，人类的CD2AP分子与小鼠非常相似，在人体内CD2AP主要在肾小球的足细胞及 T细胞和自然杀伤细胞(NK细胞)表面表达，在脑毛细血管、集合管、近端肾小管及远端肾小管细胞等也有少量表达[15]。

2 CD2AP与肾脏疾病的关系

CD2AP作为足细胞的重要蛋白之一，其特殊的SH3结构使其可以与足细胞的其他蛋白分子如α-辅肌动蛋白-4(a-actinin-4，ACTN4)、膜蛋白(Podocin)、足细胞裂孔隔膜特异蛋白(Nephrin)等相互作用，一起维持足细胞SD的正常形态和生理功能[16]。多项实验证实，CD2AP表达下降、缺失、损伤均会影响足细胞SD的生理功能，引起足细胞的细胞骨架破坏，影响滤过膜的通透性，从而出现大量蛋白尿[3-5]。而CD2AP基因剔除的小鼠在出生后约4周会出现肾衰竭和肾病综合征，并在6周时死亡[3]。局灶节段性肾小球硬化症(focal segmental glomerular sclerosis，FSGS)患者存在CD2AP突变，且激素耐药型的FSGS患者可检测出杂合CD2AP突变[17]。CD2AP纯合子突变小鼠表现出严重的肾病综合征，伴有系膜细胞硬化，CD2AP单倍体功能不全的小鼠在9月龄时肾脏表现为系膜扩张和高细胞性，将CD2AP基因转入足细胞后可降低CD2AP纯合子突变株的死亡率，提示CD2AP是肾足细胞功能的主要位点[4]。Tsvetkov等[18]对一名确诊为FSGS且使用类固醇及血管紧张素转换酶抑制剂抗蛋白治疗6个月后病情反复的患者进行基因测序，结果显示CD2AP中有一个杂合子p.t374a，c.1120a.g突变，突变位于CD2AP基因富含脯氨酸的编码区域，组织学检查也证实FSGS患者存在该突变。郝胜等[19]研究结果显示，原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome，PNS)患者肾组织CD2AP蛋白的表达低于正常健康者，且病理表现为FSGS的PNS患儿 CD2AP蛋白表达降低。史秀岩等[20]研究结果显示，微小病变型肾病(minimal change disease,MCD)及膜性肾病(membranous nephropathy，MN)患者肾组织CD2AP蛋白表达量均低于健康对照组。Hyvönen等[21]对2 251名Ⅰ型糖尿病患者CD2AP基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)进行分析后发现CD2AP SNP rs9369717和rs9349417与终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)相关，CD2AP基因变异可能增加Ⅰ型糖尿病患者ESRD的易感性。在FSGS、MCD、MN、糖尿病肾病等患者中均发现CD2AP基因的突变及蛋白表达量的改变，提示CD2AP基因突变为多种肾脏疾病的致病原因。

3 CD2AP在肾病中的相关分子机制

3.1 CD2AP参与多种信号转导目前多数学者认为足细胞凋亡是肾小球硬化的标志之一，是进行性肾脏疾病发展的关键一步[22]，但足细胞凋亡的分子调控尚不十分清楚。足细胞内存在多种信号通路，磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)是一种抗凋亡、促生存的信号通路，活化胞内PI-3K可使磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP 3)水平升高并使Akt磷酸化，而Akt的激活在细胞增殖、分化、凋亡和代谢调控中起重要作用[23]。在嘌呤霉素氨基核苷(puromycin aminonucleoside，PAN)肾损伤模型中，CD2AP基因的转录受到抑制，使CD2AP蛋白表达下降，分布异常，PI3K/Akt信号途径不能激活，丝氨酸蛋白激酶(glycogen synthase kinase 3β，GSK3β)磷酸化也被抑制，从而诱导足细胞凋亡[23-25]。此外，CD2AP蛋白还可调控表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)/EGFR、转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGFβ)/p38等通路。Ha等[24]研究发现糖尿病肾病患者肾脏高葡萄糖和晚期糖基化终产物(advanced glycation end-product，AGE)能降低肾脏组织CD2AP蛋白和mRNA的表达，PI3K抑制剂能阻止高糖和AGE诱导的CD2AP蛋白在滤过膜的含量和分布的变化，提示糖尿病患者PI3K/Akt信号通路可诱导足细胞CD2AP蛋白的表型发生改变，从而导致糖尿病肾病的发生。

转化生长因子(transforming growth factor，TGF)-β信号通路广泛参与细胞生长、分化、凋亡、细胞内动态平衡等过程。TGF-β被认为是足细胞损伤的中心介质，随着自分泌和旁分泌的激活，TGF-β在肾小球和肾小管间质区的信号级联被认为是所有慢性肾脏疾病(chronic kidney diseases，CKDs)的标志[26]。TGF-β可经Smad途径介导足细胞凋亡，同时亦可激活 PI3K/AKT途径，而后者需要足细胞CD2AP蛋白的参与[27]。研究发现，CD2AP可使树突蛋白转移至胞核，而树突蛋白可使胞浆组织蛋白酶L(Cathepsin L，Cat L)的表达增强，CD2AP可被Cat L蛋白水解，在足细胞损伤时促进蛋白酶的持续表达，进而增加TGF-β1诱导足细胞凋亡的敏感性[23，26]。有研究显示，糖尿病肾病患者血流动力学和代谢的变化与肾小球系膜中TGF-β1表达的增加和细胞外基质的扩张以及足细胞数量的减少相关[28]。

3.2 CD2AP参与细胞间的黏附及迁移肌动蛋白以多种方式参与细胞的黏附并维持上皮屏障功能的稳定。肌动蛋白不仅可以通过聚集膜黏附分子参与质膜结构域的形成过程，它还能通过细胞黏附分子的黏附作用稳定细胞质肌动蛋白网络的正常结构。同时，肌动蛋白还参与细胞接触部位的机械转导，从而增强细胞间的黏附，而CD2AP蛋白是维持肌动蛋白稳定性所必需的物质。CD2AP与稳定的肌动蛋白池和ACTN4蛋白共同定位于细胞间黏附处，抑制肌动蛋白丝倒刺样末端结构的动力作用，剔除CD2AP基因可使细胞黏附处的肌动蛋白减少，黏合强度降低，导致细胞之间的链接撕裂，屏障功能破坏[29]。因此，CD2AP不仅能增强细胞之间的黏附作用，使上皮细胞适应机械应力，还可增加肌动蛋白的积累和维持细胞黏附连接的稳定。研究发现，CD2AP可将肌动蛋白的加帽蛋白(capping protein，CP)招募到细胞边缘，靠近肌动蛋白丝有刺的末端并被CP覆盖，CD2AP的缺失导致CP不能正常向细胞边缘聚集，细胞周边肌动蛋白丝的动力减弱[30-31]。

白细胞黏附、爬行和迁移是通过内皮细胞机械感受器细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)的聚集来调节的。Schaefer等[32]研究发现，内皮细胞中CD2AP可与ICAM-1相互作用，这种相互作用介导ICAM-1的机械信号传递，并推动皮层肌动蛋白(cortactin)和纤维型肌动蛋白(F-actin)向黏附复合物募集；此外，CD2AP与聚集的ICAM-1结合是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)相关C3型肉毒毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1,Racl)的招募和激活所必需的；相反，Racl的活性限制了CD2AP-ICAM-1的相互作用；CD2AP是ICAM-1聚集的负调节因子，可限制ICAM-1黏附复合物的形成，阻止中性粒细胞无控制的黏附和细胞间的迁移。因此，CD2AP对ICAM-1起负调节作用，这为CD2AP在肾病中的炎症反应提供了新的理论机制。

3.3 CD2AP与其他相关蛋白的相互作用近年来研究发现，肾病蛋白、CD2AP、ACTN4、突触连接蛋白、瞬时受体电位阳离子通道蛋白等足细胞相关蛋白分子是足细胞裂孔膜的重要组成部分，共同维持着肾小球的正常生理功能[33-34]。CD2AP的三个SH3使其不仅可与足细胞裂隙膜蛋白羧基端结构域结合，还可以与肾病蛋白相结合形成复合物，共同构成足细胞的骨架，维持滤过膜的滤过功能。肾病蛋白和CD2AP通过与PI3K的p85调节亚基相互作用，激活PI3K/AKT，共同参与细胞内的信号转导[15，24]。有研究发现P85、 CD2AP、肾病蛋白可以发生免疫共沉淀，并形成肾病蛋白-CD2AP-P85复合物， CD2AP的SH3结构介导该复合物的形成[35-37]。在小鼠的动物模型中剔除小鼠CD2AP基因后，肾病蛋白基因表达减少，足细胞裂隙膜蛋白基因表达增加；剔除足细胞裂隙膜蛋白基因后，肾病蛋白基因表达减少，CD2AP基因表达增加；剔除肾病蛋白基因时，CD2AP基因表达增加，而足细胞裂隙膜蛋白基因表达不变[38]，提示三者间的关系密不可分，CD2AP基因可能发挥更加重要的作用。

接头蛋白85(Cbl-interacting protein of 85 kDa，CIN85)与CD2AP均属于适配蛋白家族中的一员，两者的序列和结构有高度的相似性，他们都包含三个SH3结构域，一个脯氨酸丰富区和一个盘绕结构域[39-41]。在CD2AP基因完全剔除(CD2AP-/-)的小鼠中足细胞的CIN85表达增强，而在无CD2AP基因缺失(CD2AP+/+)的小鼠其足细胞CIN85的表达明显减少，而且在CD2AP存在时，小泛素相关修饰因子对CIN85的类泛素化作用增强，CIN85与nephrin的结合增加[39]，这种调节共同维持狭缝隔膜分子的缝隙膜稳定性。CIN85和CD2AP的SH3结构域可相互作用，并通过激活配体参与细胞内信号受体的内吞过程，CIN 85和CD2AP还可参与大麻素受体1介导的多种受体酪氨酸激酶的信号转导[12，40]。

支架蛋白抗原1(Ras GTPase-activating-like protein，IQGAP1)是链接肌动蛋白细胞骨架与裂隙隔膜蛋白的支架蛋白，参与足细胞的运动，影响足细胞的通透性[42]。IQGAP1与足细胞缝隙隔膜内的多个蛋白质如nephrin、膜相关鸟苷酸激酶1抗体(The membrane-associated guanylate kinase with inverted，MAGI-1)、 CD2AP、 podocin、酪氨酸激酶衔接蛋白1/2(Recombinant Non Catalytic Region Of Tyrosine Kinase Adaptor Protein 1/2,NCK1/2)、ACTN4、 β连环蛋白(β-catenin)蛋白相互作用[43]，共同参与细胞骨架蛋白的调节，并且可连接细胞骨架与狭缝隔膜复合体，IQGAP1表达下调可降低足细胞的迁移，增加足细胞层的通透性，这在肾小球疾病的病理生理中具有重要意义。