正交试验法优化铁皮石斛多糖的高效高压差低温连续式提取工艺
2019-03-14宋力飞刘常青马志鹏王旭龙罗俊容永赐李伟杰
宋力飞，刘常青，马志鹏，王旭龙，罗俊，容永赐，李伟杰
(广州泽力医药科技有限公司，广东广州 510663)
铁皮石斛是一种具有药食同源属性的名贵中药材，又名铁皮兰、黑节草，为兰科石斛属植物，主要分布于我国安徽、浙江、福建等地，具有增强体质、滋阴清热、生津益胃、润肺止咳的功效，素有九大仙草之首的美名[1-2]。
铁皮石斛中含有多种化学成分，包括多糖、生物碱、氨基酸、矿物质等，其中多糖是含量较高的有效成分[3-4]。目前，植物多糖的提取技术主要是水提醇沉法、微波法、超声波辅助水提法、超临界流体萃取法等[5]，提取效率较低。本研究首次运用高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备对铁皮石斛多糖进行提取，并以多糖提取率为指标，采用正交试验法优化工艺参数，为规模化提取铁皮石斛多糖提供一定的技术支持与理论指导。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂
铁皮石斛：产地福建，经宋力飞高级工程师鉴定为兰科植物铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的茎；D-无水葡萄糖标准品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506，质量分数99.9%)；苯酚、硫酸、无水乙醇(天津市凯通化学试剂有限公司，分析纯)。
1.2 仪器与设备
高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备(HHLSE，广州泽力医药科技有限公司)；TU-1900双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；20B万能粉碎机(江苏省江阴市瑞通机械设备有限公司)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。
2 方法与结果
2.1 工艺流程
本研究是在小试(每次试验量约为3 kg铁皮石斛粉)基础上完成的，中试为30 kg。铁皮石斛多糖提取采用水提方式(冷冻水循环，保持温度<25 ℃)，工艺流程：铁皮石斛→预处理→粉碎→高效高压差低温连续式提取→离心(渣液分离)→微滤(取清液)→反渗透(取浓液)→真空浓缩→粗多糖。
2.2 铁皮石斛多糖提取率的测定
2.2.1 标准曲线的绘制 准确称取0.100 g干燥至恒定质量的葡萄糖对照品，配制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液，分别精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL对照品溶液，加水至总体积为2 mL，加入质量分数5%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，再加浓硫酸5.0 mL，摇匀，沸水浴煮沸15 min。冰浴冷却后在490 nm处测量吸光度，以质量浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线[6-7]，得回归方程y=14.859x-0.001 3，r=0.999 2，线性范围为0～0.6 mg/mL。
2.2.2 铁皮石斛多糖提取率的测定 采用苯酚-硫酸法[6]进行测定：取真空浓缩到一定倍数的提取液1.0 mL，加水至总体积为2 mL，其余步骤“2.2.1”项下操作，得到提取液铁皮石斛多糖浓度，进而得粗多糖质量，再根据公式“多糖提取率=粗多糖质量÷铁皮石斛粉质量×100%”计算多糖提取率。
2.3 单因素试验
通过高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备对铁皮石斛多糖的提取，以多糖提取率为评价指标，在预试验的基础上，选择粉碎度、料液比、提取压力为主要影响因素进行单因素试验，考察各因素对铁皮石斛多糖提取率的影响。
2.3.1 粉碎度对多糖提取率的影响 固定料液比为1∶20，提取压力为30 MPa，确定粉碎度在网筛口径为0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mm条件下对多糖提取率的影响，结果见图1。
多糖提取率/%4035302520151050网筛口径/mm0.40.81.21.62.0
图1粉碎度对多糖提取率的影响
Figure1Effect of grinding degree on extraction rate of polysaccharides
可见，粉碎度在0.8～1.0 mm范围内，随着网筛口径的提高，对铁皮石斛的多糖提取率不断提高，粉碎度达到1.0 mm时，达到最大的多糖提取率32.9%；粉碎度大于1.0 mm时，多糖提取率的提升变化并不明显。为节约资源，将铁皮石斛的粉碎度确定为1.0 mm。
2.3.2 料液比对多糖提取率的影响 固定粉碎度为1.0 mm、提取压力为30 MPa，考察料液比在1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30条件下对多糖提取率的影响，结果见图2。
4035302520151050料液比/(g∶mL)多糖提取率/%1∶101∶151∶201∶251∶30
图2料液比对多糖提取率的影响
Figure2Effect of ratio of dried powder ofDendrobiumcandidumto water on extraction rate of polysaccharides
可见，随着料液比的增大，多糖提取率呈不断增大趋势，当料液比为1∶25时，多糖提取率最高，达到35.4%；当料液比进一步增大时，铁皮石斛的多糖提取率变得平缓且有下降的趋势。所以，确定料液比为1∶25。
2.3.3 提取压力对多糖提取率的影响 固定粉碎度为1.0 mm、料液比为1∶25，考察提取压力在25、30、35、40、45 MPa条件下对多糖提取率的影响，结果见图3。
504540353025201510502530354045提取压力/MPa多糖提取率/%
图3提取压力对多糖提取率的影响
Figure3Effect of extraction pressure on extraction rate of polysaccharides
可见，提取压力在25～40 MPa范围内，铁皮石斛多糖提取率随着提取压力的不断增大而增大，当提取压力为40 MPa时，多糖提取率达到最大值的44.8%。在此之后，随着提取压力的增大，多糖提取率的变化趋于平缓。为保护设备、节约资源，将铁皮石斛多糖提取工艺的提取压力确定为40 MPa。
2.4 正交试验设计优化铁皮石斛多糖提取工艺
2.4.1 正交试验设计 在单因素试验的结果基础上，选择对铁皮石斛多糖提取影响较大的粉碎度、料液比、提取压力等因素，以铁皮石斛多糖提取率为评价指标，运用正交试验对提取工艺条件进行优化,采用 L9(34)正交表进行试验，因素与水平见表1，使用SPSS 19.0统计软件对结果进行分析。
表1 正交试验因素与水平表Table 1 Orthogonal experimental factors and levels
2.4.2 直观分析法 铁皮石斛多糖提取工艺优化的正交试验结果见表2。可见，影响铁皮石斛多糖提取率的因素主次顺序为C(提取压力)>B(料液比)>A(粉碎度)，最佳工艺条件为A3B2C2，即：粉碎度1.2 mm，料液比1∶25，提取压力40 MPa。按此条件的试验在正交表中并没有出现，通过做补充试验，得到的多糖提取率为48.5%，大于正交试验结果中的最高值，说明利用正交试验优化铁皮石斛的多糖提取工艺是有效的。
表2 正交试验设计与结果Table 2 Orthogonal test design and results
2.4.3 方差分析 采用SPSS 19.0统计软件对正交试验的结果数据进行方差分析，结果见表3。可见，因素A、B、C的P值均<0.05，说明它们对多糖提取率的影响都具有统计学意义，其中因素C(提取压力)的影响极显著，顺序为C>B>A，结论与直观分析法的一致。
表3 方差分析结果表Table 3 Variance analysis
注：R2=0.998(调整R2=0.992)。
2.5 中试放大试验
本研究进行了3次中试(32.5 kg)放大试验，结果见表4。可见，中试结果铁皮石斛多糖提取率的RSD值为0.89%，表明所用工艺合理可行，稳定可靠；中试试验得到的平均多糖提取率为45.0%，与小试(3 kg)得到的结果有一定的差别。
表4 中试放大试验结果Table 4 The medium test results
3 讨论
目前，关于铁皮石斛多糖提取工艺的研究较多，基本上集中在实验室阶段，且研究的量很小(<10 g)，普遍采用热水浸提，得到的多糖提取率都比较低，大多在30%左右[8-9]，其中单冰冰等[10]采用均匀设计法优化热提取工艺能得到相对较高的提取率(41.3%)，但也明显小于本研究得到的结果。
本研究首次采用高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术及成套装备在低温条件下对铁皮石斛多糖进行提取，并结合正交试验法优化其提取工艺，最佳提取工艺参数为：粉碎度1.2 mm，料液比1∶25，提取压力40 MPa。中试试验时，除了粉碎度和料液比保持一致，提取压力调整为一定的范围，原因是提取器的工作原理是电机带动柱塞往复运动，使料液加压通过突然变窄的出口，进而达到高压破壁的提取效果；但由于出口很窄，很容易造成物料粉末堆积，使突然压力升高，当压力升高至一定值时，堆积在出口的物料粉末由于压力的作用冲出出口，使积蓄的压力得到释放，所以，提取压力调整为波动的范围。在优化的最佳条件下铁皮石斛多糖提取率为48.5%，而中试(32.5 kg)的结果为45.0%，小试与中试在提取率上有一些差异是因为中试的设备更大，管路更长，设备、管路中的残留损失也越多，需要在实际生产中摸索更加适宜的最佳工艺条件。
本研究以高效高压差低温连续式提取分离浓缩技术(HHLSE)及成套装备为核心，通过提取设备形成的高压差对铁皮石斛细胞进行破碎，提高了提取率，并结合膜分离、浓缩等设备达到分离浓缩，此方法的优势在于提取过程在常温甚至在20 ℃以下的条件下即可实现成分的高效提取浓缩，具有提取效率高、时间短、节能的优点，可为铁皮石斛多糖的规模化生产提供一定的理论指导。
