Notch信号通路在乳腺癌发生发展和远处转移中的作用机制

孙静，赵晖

上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科，上海200233

乳腺癌的发病率和病死率分别居女性恶性肿瘤的第1、2位[1]。全球每年约139万乳腺癌新发病例，病死约46万，其中中国乳腺癌的新发例数和病死例数分别占全世界的12.2%和9.6%[2]。远处转移可严重影响乳腺癌患者的生活质量[3]，是导致乳腺癌患者病死的主要原因。晚期乳腺癌患者最常见的远处转移为骨转移，发生率约70%[4]，其次为肝、肺、脑等其他部位转移。Notch信号通路在肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡中具有重要作用，可促进乳腺癌的发生发展。本文探讨Notch信号通路在乳腺癌发生发展及远处转移中的作用机制，为研发以Notch信号通路为靶点的新抗肿瘤药物提供理论依据。

1 Notch信号通路概述

Notch基因可编码一类高度保守的细胞表面受体，由Notch受体、Notch配体及细胞内效应器分子3部分组成。Notch基因可调控海胆和人等多种生物细胞的发育。Notch基因最早于果蝇中发现，因其功能的部分缺失在果蝇翅膀表型的部分缺失中发挥作用而命名[5]。Notch在果蝇中有1种受体（Notch）和2种配体（Delta和Serrate），在哺乳动物中，有4种受体（Notch1～4）和5种Notch配体（Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4、Jagged1和 Jagged2）[5-6]。Notch信号通路的5种配体均具有保守的N-末端结构和表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）样重复序列。与Delta-like配体不同，Jagged配体含有富含半胱氨酸的结构域[7]。

Notch受体是由细胞外结构域、跨膜区和细胞内结构域3部分组成的前体蛋白，4种Notch受体中均含有保守序列。在高尔基体内，Notch前体蛋白在S1位点被弗林蛋白酶（furin）样转化酶切割，随后作为异二聚体表达于细胞膜上。异二聚体的1个亚基中含有大部分的细胞外结构域，另1个亚基包含细胞外结构域的剩余部分、跨膜结构域和细胞内结构域，这两个亚基以非共价键的形式连接形成完整的I型受体[8]。细胞内结构域负责将Notch信号转导至细胞核[7]，与受体类似，Notch配体也是I型跨膜蛋白，其细胞外结构域含有多种EGF样重复序列和3个半胱氨酸蛋白酶Notch/Lin-12（LN）重复序列。EGF样重复序列可参与Notch配体的结合过程，因此，Notch受体胞外区是Notch配体结合并激活Notch受体的部位。Notch受体胞内区（Notch intracellular domain，NICD）含有RAM结构域、6个锚蛋白（ankyrin，ANK）重复序列和氨基酸序列PEST的反式激活结构域等。NICD是Notch受体的活性形式，RAM结构域是c启动子结合因子1/重组信号结合蛋白-Jκ（recombination signal binding protein for immunoglobulin kappa J region，RBPJκ）的主要结合部位；ANK可介导Notch受体与配体等的相互作用，在Notch信号通路中发挥重要作用，是激活Notch信号通路的增强因子；PEST结构域则与Notch受体的降解有关。

两个相邻细胞间的配体与受体结合可激活Notch信号通路，这种相互作用可诱导Notch受体发生构象变化，暴露胞外结构域中的切割位点S2，经金属蛋白酶切割后，Notch受体在切割位点S3处经膜内蛋白酶水解后释放NICD，转移到细胞核中从而激活Notch靶基因。抑制γ-分泌酶的功能可以阻断Notch受体的最终切割，阻断Notch信号通路的转导。在NICD缺失的情况下，Notch靶基因的转录被RBPJκ介导的阻遏物复合体抑制；而NICD存在并进入细胞核时，阻遏物复合体被破坏，与RBPJκ结合并将其转化为转录激活因子，然后NICD招募共激活因子，如mastermind样（mastermind-like，MAML）蛋白和组蛋白乙酰转移酶p300/CBP，促进Notch靶基因的转录[9]。

2 Notch信号通路与乳腺癌发生发展及远处转移的关系

2.1 乳腺癌干细胞理论

目前，已有3种乳腺癌干细胞起源理论[10]：①不适当的调控或突变将休眠的正常干细胞转化为肿瘤干细胞；②“错位体干细胞”理论；③从普通祖细胞分化而来。乳腺癌干细胞可通过CD44+/CD24-表型进行筛选，细胞表面糖蛋白CD44是乳腺癌细胞黏附、迁移和侵袭的原因之一，可通过与骨桥蛋白的相互作用促进肿瘤进展[11]；研究显示，另一种细胞表面糖蛋白CD24在肿瘤细胞的生长和转移中也可发挥一定作用[12]。乳腺癌干细胞在乳腺癌的发生和发展中发挥重要作用，可通过增强膜转运、调控DNA修复及活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除系统、解除细胞毒性药物的毒性、促进肿瘤细胞转移并导致治疗耐受[13]。

Notch信号通路在乳腺癌干细胞形成中发挥关键作用。研究表明，Notch信号通路可参与正常干细胞的自我更新和分化过程，并促进乳腺癌干细胞表型的形成[14]。Notch基因在乳腺癌起始细胞群中表达上调。Dontu等[15]研究发现，采用DSL（Delta-Serrate-LAG2）激活Notch信号通路可增加多能干细胞的数量，相反，使用Notch4阻断剂或分泌酶抑制剂（gamma-secretase inhibitor，GSI）阻断 Notch信号通路的转导，可抑制继发性乳腺癌的发生发展[16]。Farnie等[17]通过检测NICD和Notch4的表达水平，探讨Notch信号通路在乳腺导管原位癌干细胞中的作用，结果显示，阻断Notch信号通路可减少乳腺导管原位癌干细胞的形成。Harrison等[18]研究发现，乳腺癌干细胞的自我更新受Notch信号通路的调节，敲除Notch4比敲除Notch1对乳腺癌干细胞的抑制作用更明显。

2.2 Notch信号通路与乳腺癌远处转移

Notch信号通路可影响多能祖细胞增殖、分化和凋亡等多个过程。Notch基因位点突变引起的细胞干性等表型改变，表明Notch信号通路的作用具有多样性。作为Notch的主要配体之一，Jagged1是肿瘤进展的重要驱动因素，包括骨转移等。在乳腺癌中，Jagged1和Notch1表达上调与预后不良明显相关，成骨细胞过表达Jagged1基因可促进乳腺癌患者发生远处转移。Zheng等[19]研发针对Jagged1基因的人单克隆抗体15D11，可以抑制乳腺癌细胞膜Jagged1基因的表达，从而阻断其对乳腺癌的转移促进作用。小鼠模型中，15D11可减少乳腺癌的骨转移，并增加转移灶对化疗的敏感性。与Bednarz-Knoll等[20]的研究结果一致，Jagged1基因在高侵袭性的乳腺癌中表达水平较高，并可能参与乳腺癌细胞的迁移过程，导致骨转移乳腺癌患者对靶向治疗产生耐药性。

2.3 Notch信号通路与肿瘤血管生成

Notch信号通路参与肿瘤血管形成已被临床广泛认可。研究表明，Notch信号通路异常与多种血管疾病相关[21]。常染色体显性遗传性脑动脉病合并皮质下梗死和白质脑病是由Notch3基因突变所致的脑动脉周围血管平滑肌细胞破坏引起的脑小血管疾病，表明Notch3基因可调控血管平滑肌细胞的作用和功能[22]。Notch3在人乳腺肿瘤的新生血管中表达水平较高，表明其在血管生成与维持中可发挥一定作用。原位杂交和定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）发现，Delta样典型缺口配体4（delta-like canonical Notch ligand 4，DLL4）在正常乳腺组织中不表达，但在乳腺癌的脉管系统中表达水平较高，且在肿瘤组织中，DLL4mRNA的表达水平与血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）呈正相关[23]。Mailhos等[24]进行的动物实验中，将敲除DLL4的人乳腺癌MCF7细胞系种植于小鼠皮下，结果显示，DLL4mRNA在瘤体脉管系统内表达水平较高。Zeng等[25]研究发现，Jagged1的表达水平与肿瘤中的血管密度相关。雌激素可上调人乳腺癌MCF7细胞和内皮细胞中Jagged1和Notch1的表达，促进血管网络形成[26]。Notch信号通路在乳腺癌血管生成中发挥重要作用，Jagged1和DLL4是影响肿瘤细胞和相邻细胞相互作用并参与血管形成的关键配体，Jagged1可参与肿瘤细胞的生长、增殖、转移等多个过程，促进肿瘤干细胞的形成和治疗耐受；DLL4参与肿瘤血管生成的主要过程。

3 Notch信号通路与乳腺癌的治疗

一般情况下，Notch信号通路异常可起致癌作用，因此，阻断Notch信号通路的表达可能成为肿瘤治疗的新方向。多种分子可阻断Notch信号转导通路的不同位点，如Notch受体和配体可以被单克隆抗体或RNA干扰（RNA interference，RNAi）介导的沉默基因抑制[27]。研究显示，Notch配体介导的Notch受体激活可被可溶性配体、受体诱饵、参与糖基化或受体切割酶的抑制剂阻断[28]。Notch信号通路下游的信号分子RBPJκ、MAML、HES和HEY是阻断Notch信号通路的靶点，还可以通过上调Notch拮抗剂（如Numb、Deltex等）的表达阻断Notch信号通路的表达。

γ-分泌酶小分子抑制剂是阻断Notch信号通路转导的最佳因子。GSI可抑制肿瘤发生和血管生成，目前，已经研制出多种类似的GSI，可能成为Notch信号通路新的治疗靶点。研究显示，抑制γ-分泌酶的表达可抑制NICD向细胞核的释放[29]。其他γ-分泌酶抑制剂，如SAHM1和TR4，可通过抑制RBPJκ/NICD/MAML转录激活因子复合物的形成来抑制Notch受体的表达，且SAHM1和TR4均是抗体，耐受性良好[30]。Li等[31]的研究结果显示，肿瘤细胞表达的DLL4可激活宿主基质/内皮细胞中的Notch信号转导过程，促进血管的生成，并改善肿瘤血管的功能。表达DLL4的肿瘤细胞对接受贝伐珠单抗治疗的抗VEGF治疗有反应，为研制新的阻断DLL4/Notch信号转导通路的抗血管生成药物提供了合理的基础，联合阻断DLL4和VEGF，可以改善抗血管生成治疗的效果。目前，研究显示，长期使用Notch抑制剂与肿瘤的发生相关，单独使用Notch抑制剂不能促进肿瘤细胞凋亡[32]。而Notch抑制剂与现有疗法的联合治疗可使耐药的雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性乳腺癌患者重新对抗雌激素和抗HER2治疗敏感，从而得到更理想的效果[33-34]。

4 小结与展望

Notch信号通路与乳腺癌的发生发展密切相关，该信号通路可调控细胞的增殖、分化和凋亡等多种生理过程，Notch配体与受体间异常的相互作用也可诱导肿瘤的发生，同时调控肿瘤血管生成，为肿瘤的形成、维持、发展和转移提供条件。Notch1～4与DLL4蛋白间的相互作用，可促进乳腺癌的发展与转移。Notch信号通路在调控细胞生长和肿瘤形成过程中具有高度的保守性，因此，可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。未来的临床研究应重点探索参与不同类型乳腺癌发生发展和远处转移的Notch家族成员及相应的作用机制。进一步研制选择性针对参与不同类型乳腺癌的Notch信号分子的抗肿瘤药物，识别最有可能受益于Notch抑制剂的患者，从而为乳腺癌的治疗提供参考，目前，研究结果显示，抑制Notch信号通路的单克隆抗体具有潜在的治疗价值，其与现有疗法相结合的创新疗法可能改善耐药的问题，为乳腺癌治疗提供新方向。