有氧运动干预父系C57BL/6J小鼠对雄性子代骨骼肌mTOR信号通路的影响

2019-03-14于春霞王巍褚晓蕾傅力

中国运动医学杂志 2019年2期

于春霞王巍褚晓蕾傅力

1 天津医科大学生理学与病理生理学系（天津 300070）

2 天津市天津医院康复科（天津 300210）

骨骼肌约占哺乳动物体重的40%，是维持机体餐后血糖、促进葡萄糖摄取利用的最大组织器官[1]。骨骼肌含量降低可导致多种代谢紊乱的发生，包括肥胖和胰岛素抵抗[2，3]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian Target of Rapamycin，mTOR）是哺乳动物细胞内感受细胞外运动刺激、营养状态等信号变化的一种丝/苏氨酸蛋白激酶，包含两种蛋白复合物mTORC1和mTORC2。当细胞外环境发生变化时，mTOR能够激活下游的效应蛋白核糖体蛋白S6激酶1（Ribosomal Protein S6 Kinase 1，S6K1）参与调节细胞生长、分化增殖以及蛋白质合成过程[4]。骨骼肌是人体最大的组织，机械制动小鼠后肢7天后可显著降低小鼠后肢肌肉质量，同时骨骼肌细胞mTOR信号通路及真核翻译起始因子（eIF）4E结合蛋1（eukaryotic translation initiation factor 4E-binding protein 1，4E-BP1）的合成显著下降[5]。给制动小鼠后肢注射雷帕霉素则显著抑制小鼠骨骼肌中p70S6K（Thr389）磷酸化水平，进一步加重小鼠后肢骨骼肌萎缩程度[5]。而规律有氧运动可有效激活骨骼肌mTOR信号通路，雄性SD大鼠经1周跑台运动干预，其腓肠肌蛋白质合成水平、Akt（Ser473）、mTOR（Ser2448）、p70S6K（Thr389）和 4E-BP1（Thr37/46）磷酸化蛋白的表达及4E-BP1蛋白表达均显著高于安静对照组大鼠[6]。提示mTOR信号通路的激活是促进骨骼肌蛋白合成的关键因素[6]。然而，以上研究多局限于运动干预对实验对象本身的影响，而运动干预亲代对其子代影响的研究尚不多见[7]。流行病学调查发现，父母的生活方式及生活环境均可对子代健康产生深远影响[8]。母亲孕期或哺乳期肥胖会显著增加后代代谢综合征[9]的发病率，并降低后代的学习及运动能力[10]。而母亲孕期规律的游泳训练，可有效降低后代的疾病易感性[11，12]，然而关于运动干预父系小鼠对后代健康的影响却鲜见报道。我们前期研究发现，高脂饮食/有氧运动干预父代C57BL/6小鼠能够对其子代糖、脂代谢及学习记忆能力产生影响，但仅限于雄性子代[13]。关于干预亲代对后代健康影响存在性别差异的观点，Gilbert等研究也认为可能与两性胚胎对发育环境的适应性及雌雄激素对疾病发生发展的影响不同所致[14]。在人类及动物研究中发现，性别所导致的表型差异可能受胎盘基因表达的影响，而胎盘基因表达位于X染色体的基因相对较少[14]，这也进一步佐证干预父系小鼠对其雌性后代某些表型影响较小的可能原因。因此，本研究以C57BL/6J小鼠为实验对象，通过对父系小鼠进行6周跑台运动干预，选择雄性F1代小鼠的体重、骨骼肌湿重、骨骼肌湿重/体重比值、骨骼肌抓力/体重比值及骨骼肌mTOR信号通路关键蛋白表达的差异，探究运动干预父系小鼠对雄性子代小鼠骨骼肌mTOR信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物饲养

8周龄健康C57BL/6J小鼠20只（雌雄各10只），体重为24～27 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司。分笼饲养于天津医科大学无特定病原体（SPF）实验动物中心。室内环境温度维持在20°C～25°C，相对湿度为40%～60%，给予正常小鼠饲料、自由进食水，光照12小时/天。

1.2 动物分组与运动模型建立

小鼠适应性喂养1周后，随机选取雌、雄小鼠按1∶1合笼，次日晨检查雌鼠外阴处精栓，如发现精栓后将雄鼠移出，孕鼠单独饲养至分娩。新生鼠（F0）母乳喂养21天后断乳，每窝选取3只雄性小鼠为F0代运动组，另3只同窝雄性小鼠为F0代安静组。运动组小鼠首次跑台训练速度为8 m/min，隔天递增至12 m/min（强度相当于75%VO2max）[15]适应性训练1周。之后连续进行6周跑台运动干预：5次/周，1次/天，60 min/次[16]。6周跑台干预后，运动组和安静组小鼠分别与同窝未干预的雌性小鼠按1∶1合笼交配。次日晨检查雌鼠外阴处精栓，如发现精栓后将雄鼠移出，孕鼠单独喂养至分娩。分娩后的小鼠为F1代。分别从F0代安静组与运动组小鼠中各选取6只F1代雄性小鼠分为安静组（CM）和运动组（EM）作为本实验研究对象。

1.3 抓力测试

称量并记录CM和EM组小鼠体重后逐一进行抓力测试：校准抓力测试仪后按下测定键，将小鼠置于抓力板上，抓住鼠尾轻轻后拉，待小鼠抓牢抓力板后，均匀用力后拉，仪器自动记录小鼠的抓力值，测量3次取平均值即为该只小鼠的抓力大小。为了比较的标准化，小鼠抓力测试结果以抓力/体重作为评定标准。

1.4 处死小鼠及组织留取

抓力测试结束后，小鼠禁食14～16小时，自由饮水。动物处死前称重，处死后，分离小鼠股四头肌，一侧置于4%多聚甲醛内固定，用于HE染色。另一侧组织迅速置于液氮中，后转入－80°C冰箱保存。

1.5 股四头肌组织学检测

股四头肌置4%多聚甲醛内固定24～48 h，随后转置30%蔗糖溶液中脱水，OCT包埋，切片；脱蜡，水化，苏木精染色，盐酸酒精分化，自来水冲洗，脱水，透明，封片。每组随机选取6个标本，分别选取12张切片，每张切片随机选取5个视野，计算该切片骨骼肌横截面积。

1.6 Western Blot方法检测股四头肌组织PI 3 K、Akt、mTOR、 S 6 K 1以及 4E-BP 1蛋白及相应磷酸化蛋白的表达水平

NP-40法提取骨骼肌组织蛋白。每100 mg组织加入裂解液500 μl，1×Protease Inhibitor 4 μl和1×Phosphatase Inhibitor 4 μl，研磨器充分研磨组织，然后于4°C，12000 g离心40分钟，取上清，BCA法测定蛋白浓度后转置－80°C冰箱冻存备用。

依据BCA法所测的蛋白浓度，在上样孔内加入等量的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，将蛋白转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉室温封闭1小时后，将膜与含有5%BSA的抗体稀释液稀释的一抗4°C孵育过夜（实验选用一抗分别为抗 S6K1、PI3Kp85（Tyr458）、Akt，pAkt-Ser473、pmTOR-Ser2448、p4E-BP1-Thr37/46抗体购自CST公司；mTOR、pS6K1-Thr389购自Abcam公司）。次日用1×TBST洗膜3次，每次10分钟；用5%BSA溶液稀释二抗（实验选用二抗为HPR标记山羊抗兔IgG和HPR标记的山羊抗小鼠IgG购自CST公司），室温孵育1小时，再用1×TBST洗膜3次，每次10分钟；最后用ECL化学发光试剂和X光片检测蛋白信号。

1.7 统计学方法

所有实验数据由SPSS统计软件（SPSS13.0 for Windows）处理，计算均值和标准差（±s），采用独立样本t检验，各组间差异性检验的显著性水平定为P＜0.05。

2 结果

2.1 表型实验结果

F1代小鼠表型差异如表1所示，与CM相比，EM组小鼠体重、股四头肌湿重、股四头肌湿重/体重及抓力/体重比值分别增加了12.76%、23.50%、9.73%及21.50%，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示跑台运动干预父系小鼠促进了F1代雄性小鼠骨骼肌发育。

表1 各组F1代雄性小鼠表型的比较（ n=6）

2.2 HE染色

光学显微镜观察小鼠骨骼肌HE染色结果如图1A所示。HE染色结果经Image J软件分析，显示EM组小鼠股四头肌细胞横截面积较对照组增加30.26%（图1B，P＜0.05）。

图1 F1代小鼠股四头肌纤维HE染色结果分析（400×）

2.3 F1代雄性小鼠股四头肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1及p4E-BP 1蛋白及磷酸化蛋白表达水平

F1代雄性小鼠股四头肌PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及p4E-BP1蛋白及其磷酸化蛋白表达水平（图2，3，4）。与CM组相比，EM组小鼠股四头肌组织PI3K、Akt、mTOR 以及S6K1蛋白表达水平均有所增加，但均无统计学差异（P＞0.05）；而pAkt，pmTOR，pS6K1以及p4E-BP1蛋白的表达水平较对照组相比均显著增加（P＜0.05）。

图2 F1代雄性小鼠股四头肌组织PI3K及p4E-BP1蛋白的表达水平

图3 F1代雄性小鼠股四头肌组织S6K 1以及相应磷酸化蛋白的表达水平

图4 F1代雄性小鼠股四头肌组织Akt、m TOR以及相应磷酸化蛋白的表达水平

3 讨论

骨骼肌作为机体最大的内分泌器官之一，可通过多种信号通路与各个器官组织（肝脏、胰腺、脂肪组织等）进行信息传递，以维持机体代谢稳态[17]。研究证实，mTOR信号通路在骨骼肌生长发育过程中发挥了重要作用[4]，然而，关于有氧运动干预父系对子代骨骼肌mTOR信号通路的影响目前未见报道。本实验通过对父系C57BL/6J小鼠进行6周跑台运动干预，通过记录其子代体重、股四头肌湿重及股四头肌湿重/体重比值、抓力测试、股四头肌H&E染色，并检测子代小鼠骨骼肌mTOR信号通路的活性发现，父系6周跑台训练可显著增加子代雄性小鼠骨骼肌的重量、股四头肌横截面积及抓力。此外，运动组小鼠子代股四头肌组织PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表达水平较对照组均有所增加，其中Akt、mTOR、S6K1以及4EBP1磷酸化蛋白表达水平较对照组显著提高，提示运动干预父系小鼠增加雄性子代骨骼肌体积可能与子代骨骼肌mTOR信号通路活性增强有关。

3.1 亲代所处的环境因素对后代的影响

流行病学调查发现，近30年来全球儿童及青少年罹患超重或肥胖症的概率较之前增加3～6倍[18]。其中，70%的发病原因来自于遗传[19]，而环境因素对表观遗传的修饰可能是引起幼年代谢紊乱的重要原因[20]。传统观念认为，母亲自身及孕期所处的生活环境及生活方式对后代健康影响至关重要。而如今，越来越多的研究表明，父亲的生活方式及生活环境对后代的影响也极为显著[21]。例如，Dorosty等发现，父母双方均为健康体重的情况下，后代发生肥胖的概率仅为24%，而当父亲单方肥胖时，后代罹患肥胖症的概率可增至67%[22]。运动作为减脂减重，促进健康的重要手段，孕妇孕期规律的运动训练可显著降低后代发生肥胖、2型糖尿病等代谢性疾病的发病风险，而运动干预父亲对子代健康影响的研究并不多见[23]。Murashov等在对雄性小鼠进行了12周自主跑轮训练干预后，发现其子代小鼠在高脂饮食诱导下较对照组子代体重增长速度更慢，且血清葡萄糖及胰岛素水平也更低。此外，父系小鼠的长期运动干预也可显著提高子代小鼠骨骼肌糖基转移酶（O-GlcNAc transferase，Ogt）、糖苷酶（O-GlcNA-case，Oga）、葡萄糖转运蛋白 4（glucose transporter 4，GLUT4）等代谢基因的表达[21]。与此相似，Krout等通过对雄性小鼠进行高脂饮食和/或跑轮运动干预12周后与同窝雌鼠交配，获取的雄性子代断乳后持续高脂饮食喂养12周后发现，两组雄性子代小鼠体脂含量并无显著差别，而运动组子代小鼠血清葡萄糖含量较对照组显著降低，推测可能与运动组子代小鼠骨骼肌GLUT4、胰岛素受体底物1（insulin receptor substrate 1，IRS1）、磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3-kinases，PI3K）等胰岛素信号分子高表达有关[23]。以上结果提示，父系饮食因素可显著影响后代对疾病的易感性，同时也为揭示父系生活方式可能影响其后代表型提供了宝贵线索。

3.2 6周有氧跑台运动干预父系小鼠对子代雄性小鼠骨骼肌 mTOR信号通路的影响

骨骼肌具有高度的可塑性，作为机体最大的蛋白质储存库，骨骼肌蛋白质代谢是机体适应运动训练过程中的关键环节。目前对这种适应机制的研究主要集中于骨骼肌内细胞信号转导的调控[24]。研究证实，运动促进骨骼肌肥大的主要信号通路为PI3K/Akt/mTOR途径[24]。PI3K/Akt/mTOR信号通路的信号分子主要包括PI3K，Akt，mTOR，S6K1和4E-BP1。S6K1和4EBP1是其下游的主要作用靶物，mTOR的促合成效应主要通过促进其下游的S6K1和4E-BP1磷酸化实现的[23]。研究表明，S6K1和4E-BP1与骨骼肌蛋白质合成直接相关[25]，小鼠全身敲除S6K1后可导致骨骼肌显著萎缩[26，27]。同样，直接磷酸化S6K1和4E-BP1可显著促进小鼠蛋白合成进而诱导其骨骼肌肥大[28]。本实验通过对父系小鼠进行6周跑台运动干预，发现F1代雄性小鼠股四头肌横截面积及其股四头肌中PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表达水平较对照组均有所增加，其中Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白表达水平较对照组增加显著。考虑到父系遗传对雌、雄子代影响的差异性[14]，并结合我们的前期研究发现，父系6周跑台训练干预可增强子代雄性小鼠的空间学习记忆能力，推测可能与子代雄性小鼠海马神经元数目的增加有密切关系，雄性子代海马组织内BDNF、Reelin基因和蛋白表达增加影响海马神经元数目，从而提高学习记忆能力，但对雌性子代影响效果不明显[13]。关于干预亲代对后代健康影响存在性别差异的观点，Gilber等认为可能与两性胚胎对发育环境的适应性及雌雄激素对疾病发生发展的影响不同所致[14]。性别导致的表型差异可能受胎盘基因表达的影响，而胎盘表达位于X染色体的基因相对较少[14]，这也进一步佐证父系干预对雌性后代某些表型影响较小的可能原因。因此，本研究在对父系小鼠进行6周跑台运动干预后，通过对比子代雄性小鼠体重、骨骼肌湿重、骨骼肌湿重/体重比值、骨骼肌抓力/体重比值后发现，父系运动干预有效促进了雄性子代的生长发育。因此后续实验将着重探究父系运动干预对雄性子代骨骼肌mTOR信号通路的影响。结果发现，父系6周有氧跑台训练增加了子代雄性小鼠股四头肌组织PI3K、Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1蛋白表达，其中Akt、mTOR、S6K1以及4E-BP1磷酸化蛋白表达水平较对照组显著增加，提示运动干预父系小鼠可能通过激活子代雄性小鼠股四头肌组织mTOR信号通路促进相关分子磷酸化蛋白的表达，促进蛋白质合成，进而促进子代雄性小鼠骨骼肌肥大，增加骨骼肌的湿重及抓力。