鼻咽癌及其不同临床分期microRNA表达特征*

周小军 林葆睿

1广州中医药大学附属中山医院耳鼻咽喉科（中山市，528400）

microRNA（miR）是一类长度约为19～25个核苷酸的非编码单链小RNA分子，通过与靶基因的3′端非翻译区互补配对结合的方法，非常复杂地调控内源基因的表达，与生物的生长发育及多种疾病如肿瘤等密切相关，癌的起始和发展都涉及miR的改变。癌细胞中miR的表达水平异于正常组织而用于揭示人类癌症发病机理，miR已成为肿瘤的诊断、分期、预后和疗效相关的标记物，为目前癌症研究的前沿和热点。鼻咽癌为好发于中国南方的具有明显地域特性的肿瘤，号称广东瘤，恶性程度高，易发生淋巴结和全身转移。既往已有专家研究了鼻咽癌miR特征[1-3]，但由于样本及研究技术的限制，使得本研究有继续研究的需要。本研究选择在全世界鼻咽癌最高发区之一的广东省中山市进行，同时研究miR与鼻咽癌分期、病理的关系，报道如下。

资料与方法

1 临床资料

病例来源于广东中山市中医院门诊病例，时间从2014年5月～2015年10月，其中鼻咽癌患者17例，年龄 22～64岁，平均（46.47±11.17）岁，男 11例，女6例。

以鼻咽内镜检查及增强CT确定鼻咽癌肿块大小及浸润情况，以增强CT和/或颈部彩超确定颈部淋巴结的转移，全身肝胆脾肾B超及胸部X线检查确定有无鼻咽癌全身转移，鼻咽癌分期标准参见中国鼻咽癌2008年福州标准[4]，17例鼻咽癌，包括Ⅱ期6例，Ⅲ期6例，Ⅳ期5例。

鼻咽癌病理分类标准参照国际标准[5]，17例鼻咽癌包括分化型非角化性癌10例，未分化型癌7例。

慢性鼻咽炎患者12例，年龄20～55岁，平均（34.17±11.25）岁，男 8例，女 4例。

所有临床病人在取得知情同意签字后取鼻咽组织行病理诊断，另一份标本置-80℃冰箱中保存待测。

2 miR Array

miRCURY LNATMmicroRNA Array（Exiqon，丹麦），探针数达3100个，覆盖miRBase数据库人、小鼠、大鼠三物种全部miR及与三物种相关的所有病毒的miR，此芯片采用LNA专利捕获探针技术，LNA是一类寡核苷酸衍生物，在寡核苷酸链中掺入LNA而制备的LNA捕获探针，可升高熔解温度（Tm），并且可以自由设计Tm值，从而实现Tm值均一化（72℃），保证了对所有靶点具有相同的亲和性，且杂交温度高可有效地避免非特异性杂交信号，从而具有高灵敏和高特异性（能检测单碱基差异的miR）。在miR表达分析领域具有国际领先地位。

3 实验方法

3.1 样品RNA提取及质量控制

取-80℃保存的待检鼻咽组织100mg，使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。使用Nanodrop ND-1000测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。样品质量可靠，结果见表1。

表1 鼻咽癌组织明显上调的miR

m i R 上调倍数 P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-5 5 0 b-2-5 p 5.1 4 8 0.0 1 9 h s a-m i R-5 1 3 b-5 p 4.8 3 2 0.0 0 2 0.6 2 9±0.6 5 5 0.1 5 4±0.0 9 4 h s a-m i R-1 2 5 5 b-2-3 p 4.5 8 1 0.0 0 5 0.0 5 3±0.0 3 0 0.2 4 2±0.1 4 6 0.1 2 2±0.1 8 0 0.0 3 2±0.0 2 0 h s a-m i R-4 7 4 8 4.4 4 2 0.0 4 6 0.0 3 0±0.0 2 2 0.1 3 4±0.1 5 5 h s a-m i R-3 7 8 c 4.2 7 4 0.0 2 9 0.1 3 1±0.1 4 1 0.5 5 8±0.5 7 1 h s a-m i R-3 4 0-5 p 4.1 7 4 0.0 1 5 1.3 4 7±0.8 0 0 5.6 2 3±5.4 8 2 h s a-m i R-3 9 4 5 4.1 5 4 0.0 0 4 0.0 2 2±0.0 1 6 0.0 9 2±0.0 6 1 h s a-m i R-4 4 3 1 4.1 3 3 0.0 0 0 0.4 1 0±0.1 6 1 1.6 9 5±1.0 5 9 h s v 2-m i R-H 3 4.0 4 8 0.0 4 9 0.0 3 2±0.0 3 8 0.1 2 9±0.1 2 2 h s a-m i R-5 0 8 9-5 p 4.0 4 2 0.0 2 4 0.4 3 1±0.4 7 2 1.7 4 3±1.5 2 8 h s a-m i R-4 2 5 3 3.8 1 7 0.0 1 3 0.0 0 3±0.0 0 2 0.0 1 0±0.0 0 2 h s a-m i R-9 9 a-5 p 3.7 3 1 0.0 0 6 0.2 6 0±0.2 9 4 0.9 6 7±0.6 1 3 e b v-m i R-B A R T 1 8-3 p 3.7 2 1 0.0 0 5 0.4 1 6±0.4 4 4 1.5 5 0±1.1 8 8 h s a-m i R-1 6-2-3 p 3.6 3 0 0.0 2 1 0.2 8 6±0.2 2 5 1.0 3 8±1.0 0 4 h s a-m i R-4 5 2 9-3 p 3.6 1 2 0.0 0 9 0.0 8 3±0.0 8 0 0.3 0 0±0.1 9 4 h s a-m i R-1 9 1-5 p 3.6 1 2 0.0 4 8 2.2 4 5±1.5 5 8 8.1 0 8±9.3 8 5 h s a-m i R-4 5 2-5 p 3.5 2 4 0.0 0 9 0.1 0 2±0.0 8 8 0.3 6 0±0.2 7 0 h s a-m i R-1 7-5 p 3.5 2 2 0.0 1 7 0.4 2 2±0.1 4 9 1.4 8 8±1.1 9 3 h s a-m i R-4 3 2 2 3.4 0 3 0.0 4 1 0.0 0 4±0.0 0 3 0.0 1 3±0.0 0 5 h c m v-m i R-U S 2 5-1-3 p 3.2 1 0 0.0 0 0 0.0 7 4±0.0 4 0 0.2 3 6±0.1 2 4 h s a-m i R-3 3 9-5 p 3.2 0 6 0.0 1 3 0.2 3 8±0.1 8 4 0.7 6 4±0.6 4 3 h s a-m i R-3 7 8 e 3.1 1 8 0.0 1 4 0.1 2 3±0.1 1 2 0.3 8 3±0.2 9 8 h s a-m i R-4 2 5-5 p 3.1 0 7 0.0 2 9 0.1 6 9±0.0 9 1 0.5 2 6±0.4 0 7 h s a-m i R-4 7 7 3 3.1 0 2 0.0 4 3 0.0 2 1±0.0 1 9 0.0 6 4±0.0 2 2 h s a-m i R-3 1 7 5 3.0 4 8 0.0 4 2 0.4 7 2±0.6 3 5 1.4 3 8±1.4 1 7 h s a-m i R-3 7 8 b 3.0 3 3 0.0 0 5 0.1 2 0±0.1 0 4 0.3 6 5±0.2 3 7 h s a-m i R-4 3 3-5 p 3.0 2 8 0.0 3 7 2.7 8 8±0.8 4 2 8.4 4 4±8.5 9 1 h s a-m i R-4 6 7 3 2.9 9 8 0.0 2 9 0.0 3 6±0.0 2 6 0.1 0 9±0.0 9 2 h s a-m i R-6 7 6-5 p 2.9 7 1 0.0 1 6 0.0 1 1±0.0 0 3 0.0 3 2±0.0 1 2 h s a-l e t-7 c-3 p 2.9 2 1 0.0 4 5 0.0 4 3±0.0 2 6 0.1 2 6±0.0 8 8 h s a-m i R-5 8 7 2.9 1 6 0.0 4 1 0.0 0 2±0.0 0 2 0.0 0 7±0.0 0 2 h s a-m i R-4 6 7 7-3 p 2.9 0 4 0.0 4 0 0.0 9 8±0.0 9 0 0.2 8 4±0.2 4 9 h s a-m i R-2 0 0 b-3 p 2.9 0 0 0.0 1 3 1.3 6 0±1.1 0 8 3.9 4 5±3.1 0 3 h s a-m i R-1 0 6 a-5 p 2.8 8 8 0.0 4 1 0.3 2 6±0.3 1 2 0.9 4 2±0.7 9 2 h s a-m i R-3 9 3 4-5 p 2.8 7 4 0.0 0 2 0.0 6 8±0.0 4 5 0.1 9 6±0.1 1 5 h s a-m i R-1 8 1 a-5 p 2.8 7 3 0.0 3 2 1.7 8 5±1.8 4 2 5.1 2 8±4.6 6 5 h s a-m i R-1 8 1 d-5 p 2.8 2 9 0.0 2 6 0.2 6 7±0.2 3 0 0.7 5 6±0.6 6 6 h s a-m i R-4 3 1-3 p 2.8 2 5 0.0 2 4 0.0 2 2±0.0 1 9 0.0 6 2±0.0 4 6 h s a-m i R-9 2 a-2-5 p 2.7 5 1 0.0 3 4 0.0 1 8±0.0 1 4 0.0 5 0±0.0 3 0 h s a-m i R-1 0 6 b-5 p 2.7 1 4 0.0 3 3 1.4 3 6±0.8 8 4 3.8 9 9±3.5 9 6 h s a-m i R-2 1-3 p 2.5 5 7 0.0 4 2 0.2 3 8±0.1 8 8 0.6 0 8±0.4 7 3 h s a-m i R-4 4 4 1 2.4 8 4 0.0 4 7 0.5 6 0±0.2 9 6 1.3 9 2±1.3 1 1 h s a-m i R-4 7 3 6 2.4 7 1 0.0 3 5 0.0 0 4±0.0 0 1 0.0 1 1±0.0 0 3 h s a-m i R-4 8 9-3 p 2.4 5 4 0.0 1 9 0.0 2 3±0.0 0 5 0.0 5 6±0.0 2 9 h s a-m i R-1 8 a-3 p 2.3 9 7 0.0 4 4 0.0 3 3±0.0 1 6 0.0 7 9±0.0 5 2 h s a-m i R-7 1 1 2.3 7 2 0.0 0 8 0.2 0 8±0.1 1 0 0.4 9 3±0.3 2 0 h s a-m i R-4 2 3-3 p 2.3 5 6 0.0 4 2 0.2 9 3±0.1 8 8 0.6 9 0±0.6 0 1 h s a-m i R-1 8 1 b-5 p 2.3 1 0 0.0 4 9 0.2 9 7±0.2 8 3 0.6 8 6±0.5 4 6 h s a-m i R-2 0 5-5 p 2.2 8 9 0.0 1 5 6.4 0 4±3.8 5 6 1 4.6 5 7±1 0.1 7 1 h s a-m i R-3 6 1 3-5 p 2.2 4 8 0.0 1 8 0.0 1 0±0.0 0 6 0.0 2 2±0.0 0 8 h s a-m i R-9 9 b-3 p 2.2 4 3 0.0 2 9 0.3 3 9±0.1 8 8 0.7 6 0±0.5 8 9 h s a-m i R-6 1 2 2.2 2 8 0.0 0 7 0.0 3 5±0.0 2 2 0.0 7 8±0.0 4 1 h s v 1-m i R-H 1 4-3 p 2.1 9 4 0.0 0 8 0.0 8 1±0.0 5 7 0.1 7 7±0.0 9 6 h s a-m i R-5 1 8 8 2.1 4 5 0.0 0 2 0.0 4 7±0.0 3 0 0.1 0 1±0.0 3 6

m i R 上调倍数 P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-3 1 7 8 2.0 7 4 0.0 4 1 h s a-m i R-4 6 9 0-5 p 2.0 5 0 0.0 3 6 1.7 9 3±1.2 8 9 0.0 7 4±0.0 4 2 h s a-m i R-5 5 2-3 p 2.0 4 8 0.0 4 1 0.0 4 9±0.0 2 6 0.1 0 0±0.0 6 4 0.8 6 4±0.6 7 5 0.0 3 6±0.0 2 7 h s a-m i R-1 8 3-5 p 2.0 4 3 0.0 1 9 0.2 9 2±0.1 8 1 0.5 9 7±0.3 8 1 h s a-m i R-7 6 5 2.0 3 8 0.0 3 7 0.0 5 1±0.0 3 8 0.1 0 5±0.0 7 4 h s a-m i R-3 6 7 0 2.0 0 6 0.0 0 4 0.0 8 8±0.0 5 8 0.1 7 6±0.0 4 6 h s a-m i R-3 0 b-5 p 2.0 0 5 0.0 2 6 0.5 9 4±0.4 0 7 1.1 9 0±0.7 7 6 h s a-m i R-3 7 2-5 p 1.9 8 9 0.0 4 0 0.0 6 2±0.0 2 4 0.1 2 3±0.0 7 3 h s a-m i R-3 6 5 5 1.9 7 7 0.0 0 9 0.0 4 3±0.0 2 5 0.0 8 4±0.0 3 8 h s a-m i R-6 7 6-3 p 1.9 2 5 0.0 3 7 0.0 2 8±0.0 2 3 0.0 5 4±0.0 2 6 h s a-m i R-3 0 e-3 p 1.9 0 3 0.0 4 4 0.4 4 4±0.2 4 6 0.8 4 6±0.6 0 0 h s a-m i R-8 8 7-3 p 1.8 6 5 0.0 0 7 0.0 5 0±0.0 2 2 0.0 9 2±0.0 3 5 h s a-m i R-1 2 7 3 e 1.7 6 8 0.0 4 5 0.4 9 4±0.2 5 4 0.8 7 3±0.5 6 3 h s a-m i R-6 2 8-3 p 1.7 5 5 0.0 2 5 0.2 1 6±0.1 5 2 0.3 7 9±0.1 8 1 h s a-m i R-3 1 3 5 b 1.5 3 1 0.0 3 2 0.1 1 2±0.0 4 0 0.1 7 1±0.0 7 7

3.2 RNA标记

使用miRCURYTMArray Power Labeling kit标记试剂盒（Cat#208032-A,Exiqon）对miRNA进行标记。具体步骤如下：

①1微克的 RNA加水至 2μL加 1μL的 CIP buffer and CIP酶（Exiqon）。混合后置于 37°C下 30 min。

②将样品置于95°C下5min终止反应。加入3μL 的 labeling buffer，1.5μL 的 fluorescent label(Hy3TM)，2.0μL 的 DMSO,2.0μL 的 labeling enzyme。在16°C下反应1h。

③将样品置于65°C下15min终止反应。

3.3 RNA与芯片杂交

将待测样品与miRCURY LNATMmicroRNA Array芯片杂交，具体步骤如下：

①)25μL的样品与25μL的杂交缓冲液混合，95°C变性2min，然后置于冰上2min。

②与芯片在56°C下杂交16～20h，杂交系统为Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA。

③杂交完成后，使用Wash buffer kit（Exiqon）清洗芯片。

④图像采集及数据分析

使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。

4 统计学方法

采用SPSS 17.0进行统计分析，以P＜0.05为差异有统计学有统计学意义。

结果

1 鼻咽癌组织明显上调及下调的miR

对原始数据进行预处理及Median均一化处理后，以上调或下调差异达1.5倍以上且具有统计学差异为标准进行筛选，检测结果显示明显上调的miR 96个，其中上调2倍以上者88个，上调3倍以上者54个，见表1；明显下调的miR73个，其中下调2倍以上者24个，下调3倍以上者5个，见表1及表2。

表2 鼻咽癌组织明显下调的miR

以上结果表明：在鼻咽癌组织中，miR上调表达数量要多于下调表达，上调表达的幅度也明显大于下调表达，故miR在鼻咽癌组织中以上调表达为主。

m i R 下调倍数 P值 n o r m a l i z e d r a t i o鼻咽炎（1 2例） 鼻咽癌（1 7例）h s a-m i R-4 5 3 9 2.3 6 3 0.0 0 4 0.9 5 4±0.5 0 5 0.4 0 4±0.3 4 7 h s a-m i R-2 9 6-3 p 2.3 5 4 0.0 0 2 0.2 3 1±0.1 3 2 0.0 9 8±0.0 6 0 h s a-m i R-3 1 6 0-3 p 2.3 0 7 0.0 1 6 0.0 5 4±0.0 2 2 0.0 2 3±0.0 0 9 h s a-m i R-4 2 9 2 2.2 2 3 0.0 0 2 3.0 3 9±1.4 4 9 1.3 6 7±1.1 1 6 h s a-m i R-4 7 1 5-3 p 2.1 8 1 0.0 3 4 0.1 5 7±0.0 9 2 0.0 7 2±0.0 6 0 h s a-m i R-3 7 1 b-5 p 2.1 7 4 0.0 0 1 6.0 7 2±2.8 1 9 2.7 9 3±1.9 5 5 h s a-m i R-3 6 5 3-3 p 2.1 6 7 0.0 1 9 1 5.4 2 7±9.2 5 8 7.1 2 0±7.9 3 9 h s a-m i R-5 0 4-5 p 2.1 6 0 0.0 4 2 0.0 5 4±0.0 2 0 0.0 2 5±0.0 1 6 h s a-m i R-2 9 c-5 p 2.1 4 4 0.0 4 8 0.3 6 7±0.3 1 3 0.1 7 1±0.1 1 7 h s a-m i R-3 9 7 2 2.1 3 3 0.0 0 4 0.2 5 5±0.1 5 1 0.1 1 9±0.0 6 7 h s a-m i R-3 3 5-3 p 2.1 0 4 0.0 0 1 5.0 2 4±2.2 5 7 2.3 8 7±1.3 3 4 h s a-m i R-3 1 2 7-3 p 2.0 7 8 0.0 1 2 0.4 2 8±0.2 8 1 0.2 0 6±0.1 2 2 h s a-m i R-4 6 6 5-3 p 2.0 1 2 0.0 1 4 0.3 8 5±0.2 4 5 0.1 9 1±0.1 3 5 s v 4 0-m i R-S 1-5 p 2.0 0 8 0.0 0 1 5.9 7 7±2.2 8 8 2.9 7 7±1.6 6 8 h s a-m i R-6 6 4 b-5 p 2.0 0 1 0.0 2 8 1.0 5 5±0.7 7 0 0.5 2 7±0.4 0 2 e b v-m i R-B A R T 1 9-5 p 1.9 9 8 0.0 3 1 0.2 4 2±0.1 7 6 0.1 2 1±0.0 7 9 h s a-m i R-4 6 4 2 1.9 6 2 0.0 1 2 0.4 0 0±0.2 2 2 0.2 0 4±0.1 5 7 h s a-m i R-3 9 4 3 1.9 6 0 0.0 2 1 0.3 7 2±0.2 5 1 0.1 9 0±0.1 3 0 h s a-m i R-1 4 9-3 p 1.9 5 9 0.0 1 1 1.3 2 3±0.6 6 3 0.6 7 5±0.5 6 4 h s a-m i R-2 9 a-5 p 1.9 5 1 0.0 4 8 0.4 6 1±0.2 7 6 0.2 3 6±0.2 7 1 h s a-m i R-3 3 0-3 p 1.9 4 6 0.0 4 9 0.2 7 5±0.1 9 0 0.1 4 1±0.0 9 5 h s a-m i R-4 6 4 9-3 p 1.9 4 0 0.0 0 1 0.2 1 6±0.0 8 8 0.1 1 2±0.0 6 1 h s a-m i R-3 6 5 b-5 p 1.9 3 4 0.0 3 2 0.2 7 8±0.1 9 5 0.1 4 4±0.1 0 3 h s a-l e t-7 d-3 p 1.9 2 5 0.0 2 2 1.1 0 4±0.7 6 6 0.5 7 4±0.3 3 9 h s a-m i R-6 3 8 1.8 8 2 0.0 2 3 1.2 2 3±0.8 3 8 0.6 5 0±0.3 6 4 h s a-m i R-9 4 0 1.8 7 4 0.0 1 9 0.3 8 2±0.2 3 4 0.2 0 4±0.1 3 5 h s a-m i R-4 3 1 3 1.8 7 1 0.0 4 6 0.1 5 9±0.1 0 5 0.0 8 5±0.0 6 3 h s a-m i R-4 7 3 1-3 p 1.8 5 9 0.0 1 7 0.3 3 6±0.1 9 8 0.1 8 1±0.1 1 9 h s a-m i R-1 3 8-5 p 1.8 5 7 0.0 4 2 0.2 1 8±0.1 5 8 0.1 1 7±0.0 6 6 h s a-m i R-4 5 3 7 1.8 4 8 0.0 3 5 0.2 3 0±0.1 4 0 0.1 2 4±0.0 6 3 h s a-m i R-3 2 4-3 p 1.8 4 4 0.0 0 3 0.3 6 9±0.1 7 5 0.2 0 0±0.0 9 5 h s a-m i R-5 1 8 e-5 p* 1.8 3 2 0.0 1 1 0.9 5 5±0.5 3 2 0.5 2 1±0.2 8 6 h s a-m i R-2 1 1 5-3 p 1.8 1 7 0.0 0 7 0.2 8 2±0.1 3 4 0.1 5 5±0.0 9 3 h s a-m i R-4 6 6 8-5 p 1.8 0 7 0.0 1 4 5.1 6 6±3.0 3 6 2.8 5 9±1.4 7 3 h s a-m i R-3 1 5 0 b-5 p 1.8 0 6 0.0 4 2 0.3 3 6±0.2 3 4 0.1 8 6±0.1 3 0 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 b 1.7 9 3 0.0 1 9 0.5 0 6±0.2 9 9 0.2 8 2±0.1 6 3 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 a-3 p 1.7 9 0 0.0 2 1 0.5 7 3±0.3 5 5 0.3 2 0±0.1 7 1 h s a-m i R-4 9 1-3 p 1.7 6 0 0.0 0 3 3 9.6 9 8±1 3.7 4 3 2 2.5 5 4±1 3.0 5 8 h s a-m i R-5 1 9 e-3 p 1.7 4 4 0.0 4 9 3.9 4 3±2.6 7 0 2.2 6 1±1.0 9 9 h s v 1-m i R-H 8-3 p 1.7 2 1 0.0 2 7 2.7 3 8±1.3 3 1 1.5 9 1±1.1 9 6 h s a-m i R-3 1 4 6 1.7 0 8 0.0 0 5 0.4 5 0±0.2 3 1 0.2 6 4±0.0 6 5 h s a-m i R-5 1 0 0 1.7 0 6 0.0 1 3 2 4.5 4 3±7.3 9 2 1 4.3 8 9±1 1.1 6 3 h s a-m i R-3 7 1 4 1.6 9 4 0.0 1 6 0.5 2 1±0.2 5 8 0.3 0 7 5±0.1 7 5 h s a-m i R-4 7 8 7-5 p 1.6 9 2 0.0 1 2 1 1.3 6 1±4.4 4 7 6.7 1 3±4.3 8 8 h s a-m i R-4 3 0 0 1.6 9 1 0.0 4 9 0.6 4 8±0.4 4 0 0.3 8 3±0.2 1 9 h s a-m i R-3 6 8 9 a-5 p# 1.6 8 6 0.0 3 1 0.2 5 9±0.1 3 8 0.1 5 4±0.0 7 6 h s a-m i R-4 6 9 7-3 p 1.6 8 4 0.0 1 7 0.2 8 9±0.1 2 6 0.1 7 2±0.1 1 3 h s a-m i R-6 1 5-3 p 1.6 8 4 0.0 3 8 0.9 9 7±0.6 3 2 0.5 9 2±0.2 8 8 h s a-m i R-4 7 0 8-3 p 1.6 7 9 0.0 2 8 1 0.3 5 4±4.3 9 6 6.1 6 7±4.7 3 7 h s v 2-m i R-H 2 4 1.6 7 6 0.0 0 8 0.8 6 7±0.4 3 2 0.5 1 7±0.1 7 9 h s a-m i R-4 8 0 0-3 p 1.6 6 1 0.0 3 2 6.5 4 9±3.6 1 1 3.9 4 3±2.3 7 2 h s a-m i R-1 2 4 6 1.6 5 7 0.0 0 1 1 0.2 4 7±3.7 1 2 6.1 8 4±1.6 1 1 h s a-m i R-4 7 4 2-3 p 1.6 5 1 0.0 5 0 0.7 6 7±0.5 0 8 0.4 6 4±0.2 4 5 h s a-m i R-4 6 8 5-3 p 1.6 4 4 0.0 2 5 0.4 2 2±0.2 3 4 0.2 5 7±0.1 2 6

*hsa-miR-518e-5p 与 hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-5p 为同一个ID探针（13137）#hsa-miR-3689a-5p与hsa-miR-3689b-5p/hsa-miR-3689e为同一个ID探针（148251）

2 鼻咽癌不同临床分期差异表达的miR

鼻咽癌重要特征为浸润、扩散及转移，其不同的临床分期代表鼻咽癌发生发展的不同阶段。对原始数据进行预处理及Median均一化处理后，经统计学分析，在鼻咽癌不同临床分期存在统计学差异的miR有77个，见表3。结果显示随着鼻咽癌病情的变化（即临床分期不同），miR表达的种类及水平也可出现不同，说明miR既参与调控鼻咽癌的发生也参与调控鼻咽癌病情的进展。而同时在鼻咽癌及其不同临床分期中都参与调控作用的（即差异表达）miR有20个，其中2个miR为上调表达，见表4，18个miR为下调表达，见表5。

在鼻咽癌及鼻咽癌不同临床分期均有差异表达的miR，它们的表达也非线性关系，即在鼻咽癌高（低）表达的miR，并非依临床分期的增高（病情加重）而呈现一致性高（低）表达，如在鼻咽癌及鼻咽癌不同临床分期均高表达的2个miR，在Ⅱ期、Ⅲ期的表达为高值，而在Ⅳ期的表达为低值；在鼻咽癌及鼻咽癌不同临床分期均低表达的18个miR，其相对低表达的大部分在Ⅱ期，而相对高表达的在Ⅲ期及Ⅳ期，显示miR表达活性与临床分期的负相关性和复杂性。

表3 鼻咽癌不同临床分期有统计学差异的miR

m i R n o r m a l i z e d r a t i oⅡ期(6例)Ⅲ期(6例)Ⅳ期(5例)F值 P值h s a-m i R-3 1 2 7-3 p h s a-m i R-4 7 6 9-3 p h s a-m i R-3 1 8 4-5 p 0.3 1 3±0.1 1 6 0.4 8 1±0.1 9 1 0.3 2 7±0.1 8 0 0.1 7 5±0.0 9 9 0.3 1 8±0.1 1 7 0.0 7 0±0.0 3 4 h s a-m i R-3 7 1 4 h s a-m i R-1 4 9-3 p h s a-m i R-5 0 0 a-5 p h s a-m i R-4 8 4 h s a-m i R-1 8 b-3 p 0.1 0 8±0.0 5 6 0.2 7 8±0.0 5 9 0.1 4 3±0.1 2 4 0.1 6 4±0.0 4 4 0.6 1 0±0.3 1 5 0.2 5 3±0.1 2 4 0.2 5 2±0.1 5 9 0.1 7 3±0.1 1 5 0.4 5 7±0.1 6 3 0.3 3 0±0.2 4 5 0.1 1 4±0.1 0 7 0.5 5 0±0.2 3 9 0.5 7 9±0.2 9 7 0.3 0 0±0.1 7 5 1.1 6 8±0.8 1 5 0.3 5 3±0.1 7 1 0.3 1 6±0.1 4 9 0.3 0 9±0.2 3 6 6.5 9 3 0.0 1 1 3.7 6 0 0.0 4 9 4.9 8 7 0.0 3 9 6.8 1 6 0.0 0 9 3.9 6 8 0.0 4 3 4.4 4 6 0.0 3 2 4.0 7 4 0.0 4 0 4.8 9 4 0.0 2 4 h s a-m i R-3 1 8 0-5 p 0.1 1 0±0.0 7 3 0.2 2 9±0.1 3 6 4.3 9 4 0.0 3 3 h s a-m i R-3 6 8 7 2.3 8 0±0.9 5 2 0.5 4 4±0.4 4 9 2.0 4 4±1.3 3 5 4.9 5 8 0.0 2 7 h s a-m i R-4 7 3 1-3 p 0.0 8 4±0.0 5 1 0.2 5 7±0.1 3 0 0.2 0 6±0.1 1 0 4.5 1 6 0.0 3 1 h s a-m i R-1 4 4-3 p 1.3 2 5±1.6 6 8 0.8 1 5±0.7 5 9 4.5 7 8±3.2 3 4 5.2 7 6 0.0 2 0 h s a-m i R-2 1 1 6-5 p 0.6 5 2±0.5 7 6 1.7 5 1±1.2 0 7 0.5 8 7±0.1 8 5 3.8 2 2 0.0 4 7 h s a-m i R-6 6 5 0.7 1 0±0.3 7 8 0.2 3 9±0.1 9 5 0.4 8 7±0.2 5 0 4.0 4 1 0.0 4 1 h s a-m i R-1 2 6 9 b 0.0 2 6±0.0 0 8 0.0 9 6±0.0 7 5 0.0 2 9±0.0 1 8 4.2 7 9 0.0 4 5 h s a-m i R-4 6 8 6 0.5 3 3±0.1 8 8 0.2 3 0±0.1 8 7 0.3 8 3±0.1 9 0 3.9 0 6 0.0 4 5 h s a-m i R-6 5 9-5 p 0.0 9 1±0.0 6 7 0.0 6 4±0.0 5 4 0.2 1 8±0.0 9 7 5.7 0 9 0.0 1 8 h s a-m i R-6 3 5 0.0 9 5±0.0 7 4 0.0 4 9±0.0 6 1 0.2 0 4±0.1 1 4 4.7 9 9 0.0 2 6 h s a-m i R-2 5-5 p 0.5 9 5±0.1 6 2 0.3 6 9±0.1 7 1 0.6 3 0±0.1 1 0 4.9 7 2 0.0 2 3 h s a-m i R-1 1 8 4 0.7 1 6±0.1 7 7 0.2 8 6±0.1 6 7 0.7 5 7±0.3 0 3 5.5 8 4 0.0 2 1 h s a-m i R-9 4 0 0.0 9 5±0.0 4 2 0.2 7 2±0.1 3 0 0.2 5 2±0.1 6 3 3.9 0 4 0.0 4 5 h s a-m i R-4 4 8 1 0.2 2 7±0.0 9 3 0.0 6 6±0.0 9 9 0.1 4 1±0.0 3 5 4.9 2 9 0.0 2 7 h s a-m i R-3 3 1-5 p 0.0 2 5±0.0 2 1 0.0 9 2±0.0 5 6 0.0 7 0±0.0 2 1 5.6 6 0.0 2 h s a-m i R-1 9 a-3 p 2.6 4 3±2.1 6 6 0.4 8 9±0.3 2 1 3.8 4 3±2.9 9 7 3.7 6 6 0.0 4 9 h s a-m i R-2 0 8 a-5 p 0.4 2 3±0.1 0 5 0.6 5 2±0.1 0 5 0.4 2 8±0.1 4 8 4.9 3 3 0.0 3 0 h s a-m i R-1 4 2-3 p 1 5.4 6 2±9.7 3 0 1.0 2 2±1.0 1 5 9.6 8 8±5.5 6 6 6.2 5 5 0.0 1 4 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 b 0.1 5 8±0.0 6 6 0.4 1 6±0.1 5 9 0.2 7 0±0.1 6 1 5.6 0 4 0.0 1 6 h s a-m i R-4 4 4 5-5 p 5.5 9 7±1 1.3 8 0 2 3.4 3 2±1 8.1 0 4 1.9 6 2±0.8 6 1 4.6 1 8 0.0 2 9 h s a-m i R-1 2 5 a-3 p 0.2 3 5±0.0 7 9 0.0 9 9±0.0 8 4 0.1 9 7±0.0 5 5 4.0 3 1 0.0 4 9 h s a-m i R-2 9 c-3 p 1.3 5 8±1.2 9 9 0.1 0 2±0.1 0 1 1.4 5 3±0.4 1 4 5.0 2 0.0 2 3 h s a-m i R-1 4 0-3 p 1.2 0 4±0.9 6 6 0.8 2 5±0.9 7 8 3.2 8 7±2.0 8 4 4.8 7 2 0.0 2 5 h s a-m i R-1 3 5 a-3 p 0.0 9 2±0.0 4 8 0.0 3 7±0.0 2 5 0.0 8 5±0.0 2 3 4.3 6 0 0.0 3 4 h s a-m i R-1 5 a-5 p 1.7 8 5±1.2 0 3 0.6 5 3±0.3 7 7 2.5 2 3±1.4 7 9 4.1 2 9 0.0 3 9 h s a-m i R-1 9 5-5 p 0.1 2 3±0.0 5 4 0.0 6 8±0.0 4 9 0.3 6 0 v 0.2 5 6 5.0 8 3 0.0 2 5 h s a-m i R-2 9 a-3 p 2.5 2 8±2.2 1 5 0.4 1 2±0.3 2 7 2.5 0 1±0.9 5 6 4.1 8 9 0.0 3 8 h s a-m i R-1 2 7 3 f 0.2 5 7±0.1 6 7 0.0 6 2±0.0 6 1 0.1 9 2±0.1 0 7 4.0 7 2 0.0 4 0 h s a-m i R-4 6 6 5-3 p 0.0 7 7±0.0 4 2 0.2 7 3±0.1 2 4 0.2 2 9±0.1 5 7 4.7 9 5 0.0 2 6 h s a-m i R-4 6 4 2 0.0 8 2±0.0 3 2 0.2 9 6±0.1 7 4 0.2 3 9±0.1 7 0 3.7 8 4 0.0 4 9 h s a-m i R-4 7 5 8-3 p 0.1 5 4±0.0 9 2 3 0.0 7 4±0.0 6 5 0.3 2 6±0.0 9 9 1 2.0 8 4 0.0 0 1 h s a-m i R-5 1 8 e-5 p* 0.5 3 2±0.2 3 4 0.2 9 3±0.1 5 4 0.7 8 4±0.2 9 0 6.3 3 8 0.0 1 1 h s a-m i R-3 9 4 3 0.0 8 3±0.0 5 7 0.2 8 1±0.1 2 1 0.2 0 9±0.1 4 2 4.9 5 4 0.0 2 4 h s a-m i R-4 3 0 0 0.5 1 3±0.2 1 0 0.1 9 9±0.1 4 5 0 0.4 4 9±0.2 0 3 4.6 8 3 0.0 2 8 h s a-m i R-4 4 3 4 0.1 6 2±0.0 6 8 0.0 5 5±0.0 5 4 0.1 4 3±0.0 5 9 4.6 5 9 0.0 3 0 h s a-m i R-4 8 0 0-5 p 0.4 9 9±0.1 5 0 0.2 7 6±0.1 2 7 0.5 0 6±0.1 6 3 4.6 2 6 0.0 2 9 e b v-m i R-B H R F 1-2-3 p 0.7 4 6±0.3 6 1 0.2 2 9±0.0 4 6 0.7 4 1±0.2 7 6 5.0 0 7 0.0 2 8 h s a-m i R-5 5 7 1-5 p 0.5 5 5±0.1 6 9 1.0 3 7±0.2 0 6 0.5 0 4±0.1 1 0 1 4.0 5 4 0.0 0 1 h s a-m i R-3 3 8-3 p 0.0 6 7±0.0 1 7 0.0 0 6±0.0 0 5 0.0 6 7±0.0 2 0 1 4.3 2 8 0.0 0 2 h s a-m i R-5 5 0 b-3 p 0.1 2 0±0.0 6 7 0.1 4 4±0.1 0 1 0.3 5 8±0.2 0 9 4.7 0 7 0.0 2 9 h s a-m i R-6 6 3 a 0.6 2 5±0.1 1 0 0.2 4 2±0.1 4 3 0.5 3 2±0.2 6 0 4.9 9 7 0.0 2 9 k s h v-m i R-K 1 2-1 0 a-3 p 0.1 7 5±0.0 6 4 0.4 5 0±0.1 4 7 0.3 4 0±0.1 8 7 5.9 8 6 0.0 1 3 0.2 9 1±0.1 1 1

*hsa-miR-518e-5p 与 hsa-miR-519a-5p、hsa-miR-519b-5p、hsa-miR-519c-5p、hsa-miR-522-5p、hsa-miR-523-5p 为同一个ID探针（13137）

表4 鼻咽癌明显上调且与临床分期有关的miR

表5 鼻咽癌明显下调且与临床分期有关的miR

3 鼻咽癌不同病理类型差异表达的miR

鼻咽癌病理类型主要分为角化癌、非角化性分化型癌和未分化型癌，在鼻咽癌高发区（广东中山）主要多见后两者，其中未分化癌恶性程度高，经统计分析，相比于非角化性分化型癌，未分化癌明显下调表达的miR有6个，见表6，明显上调表达的miR有10个，见表7，显示随着鼻咽癌恶性程度升高，表达上调的miR种类增加。

表6 未分化型鼻咽癌明显下调表达miR

表7 未分化型鼻咽癌明显上调表达miR

讨论

1 miR与鼻咽癌

miR是一类在进化过程高度保守的具有时间及空间特异性表达的非编码RNA，但却可以调节超过60%的蛋白质编码基因的表达，功能广泛包括细胞增殖、分化、凋亡和发育过程，目前成为肿瘤领域研究的热点。本研究发现，在覆盖miRBase数据库三物种（人、小鼠、大鼠）全部miR表达谱芯片2800个miR中，明显上调1.5倍以上且有统计学差异的miR有96个，下调1.5倍以上且有统计学差异的miR有73个。与鼻咽癌临床分期相关的miR有77个，与鼻咽癌病理类型相关的miR有16个。miR与鼻咽癌的研究已有相当多的文献，但由于所选用的标本差异（鼻咽组织或血液）及技术差异，使得研究结果存在着差异。最近有作者[6]对既往研究采用Meta分析方法显示在鼻咽癌上调及下调分别有3个及4个miR，就包括了本研究发现上调表达的miR-205-5p及下调表达的miR-29（本研究为miR-29a-5p及 miR-29c-5p）。hsa-miR-205定位于1q32.2，在多种肿瘤中均有相关的研究报道。由于肿瘤在发生发展中具有不同的背景，miR-205在不同的肿瘤中发挥不同的作用,在乳腺癌[7]、在肺癌[8]都显著上调。

2 鼻咽癌与EB病毒miR

在上调的96个miR中，与EB病毒相关的miR数量较多（16个）而且上调的倍数也较高，包括了ebv-miR-BART1-5p、ebv-miR-BART1-3p、ebvmiR-BART4-5p、ebv-miR-BART10-3p、ebv-miRBART2-5p、ebv-miR-BART16、ebv-miR-BART12、ebv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BART5-5p、ebvmiR-BART2-3p、ebv-miR-BART9-5p、ebv-miRBART13-3p、ebv-miR-BART9-3p、ebv-miRBART8-3p、ebv-miR-BART21-3p、ebv-miRBART18-3p、高表达，仅 ebv-miR-BART19-5p低表达。这种情况在其他学者研究中也得到证实[9，10]。EBV相关miR可能通过潜伏期膜蛋白（LMP1）进而调节核转录因子（NF-κB）信号而控制细胞的生长和凋亡[9]。众所周知，EBV与鼻咽癌密切相关，临床已将EBV相关抗体检查作为早期筛查鼻咽癌的指标。而本项目的进一步研究，将使特异性EBVmiR的高表达成为鼻咽癌分子诊断指标。

3 特定miR与鼻咽癌

结合文献分析，特定miR与鼻咽癌关系分析如下。hsa-miR-378与癌症关系密切，为目前癌症研究热点，在胃癌、大肠癌表达下调，担当抑癌基因角色；在乳腺癌及肺癌表达上调，担当促癌基因角色。本研究发现 hsa-miR-378b、hsa-miR-378c、hsamiR-378e在鼻咽癌均高表达，这也在其他学者的研究中得到佐证[11]，且hsa-miR-378c还与鼻咽癌临床分期有关，主要表现为在Ⅲ期高表达，与Ⅱ期及Ⅳ期表达有明显差异。但也有相反结论[12]，显示hsamiR-378在鼻咽癌为低表达，这是否与其分期有关？特此列明。hsa-miR-29a-5p在肝癌中呈现高表达[13]，但我们研究显示hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-29c-5p在鼻咽癌均低表达，而且hsa-miR-29a-5p、hsamiR-29c-3p低表达与分期有关，其低表达主要在Ⅲ期，与Ⅱ期及Ⅳ期表达有明显差异。本研究显示hsa-miR-34在鼻咽癌低表达，其实，miR-34在多种肿瘤中包括鼻咽癌在内多呈现低表达[1]，且其低表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关，目前已倾向性认为它是肿瘤治疗的潜在靶标[14]，显示出miR-34在癌症研究中的价值。

4 miR调控的复杂性

miR调控肿瘤已成为肿瘤学研究的热点，但调控的复杂性远远超出我们的想像。miR在鼻咽癌与鼻咽炎、鼻咽癌的不同临床分期及不同病理类型均存在着表达差异，miR在鼻咽癌发病方面表达差异明显，而在其不同进展阶段及不同恶性程度的表达差异要小些，而更有特点的是，在鼻咽癌变时上调或下调的miR并未随着病情进展而继续上调或下调，多呈现负反馈表现，即表现为下调或上调。若遵循寻找“单一特征性miR对鼻咽癌诊断”这一临床思维肯定存在着缺陷，网络样miR调控鼻咽癌可能为鼻咽癌今后研究的出路。