PM2.5中丙二醛的检测、浓度特征及氧化损伤的研究

2019-03-13玉散吐拉甫迪丽努尔塔力甫苏吾比努尔热克甫图尔贡艾尔肯阿布力克木阿不力孜买丽克扎提买合木提亚力昆江吐尔逊米吉提依明

中国环境监测 2019年1期

玉散·吐拉甫，迪丽努尔·塔力甫，苏吾比努尔·热克甫，图尔贡·艾尔肯，阿布力克木·阿不力孜，买丽克扎提·买合木提，亚力昆江·吐尔逊，米吉提·依明

1.新疆大学，煤炭清洁转化与化工过程自治区重点实验室，新疆乌鲁木齐 830046 2.和田地区环境监测站，新疆和田 848000

PM2.5是重要的大气污染物，因其在大气中停留时间长，所负载的化学组分可以在大气中发生一系列光化学反应，产生毒性更大的产物[1]。有研究报道[2-3]，PM2.5的化学组成中有机物质量分数高达50%。这些有机物中的不饱和脂肪酸在大气中进一步氧化和分解，经脂质过氧化反应生成醛类、酮类和酸类等小分子化合物[1]，其中脂质过氧化物的重要代谢产物丙二醛(MDA)具有极强的生物活性，能够破坏生物大分子，可以与蛋白质或酶交联成Schiff氏碱，使酶失活并导致机体DNA突变、细胞分裂异常[4-5]。研究表明，MDA含量与一些疾病(如慢性胃炎、动脉硬化等)有关联作用[6]。通过PM2.5对动物染毒实验来检测细胞内MDA含量研究表明，随着PM2.5质量浓度增加，细胞内MDA浓度上升，细胞死亡率增大[7]。虽然对大气有关的MDA已有研究，但大部分均集中在检测动物细胞内的MDA含量，对负载在PM2.5膜中MDA含量的测定还鲜见报道。

和田市位于塔克拉干沙漠和塔里木盆地边缘，属干旱荒漠性气候，年均蒸发量(2 480 mm)与降水量(35 mm)比值高达70，风沙较多，是中国沙尘暴灾害频发区域之一。常年的沙尘暴导致和田地区生态系统非常脆弱，大气污染较为严重，经常出现PM2.5质量浓度爆表情况[8]。近年来，对和田市城区大气污染物的研究日益增多，但其大部分研究周期较短，而且主要集中于和田市大气颗粒物的粒径分布、形貌特征和化学组成的研究[9-12]，对大气颗粒物的毒性研究也偏重于问卷调查来分析沙尘暴发生时PM10质量浓度与人群呼吸道和眼部不适症状发生率的相关性[13-14]，缺少对大气PM2.5毒性的系统研究，关于PM2.5样品膜中MDA质量浓度的季节性分布及其对健康影响的研究也罕见报道。因此，研究和田市城区PM2.5膜中的MDA测定条件、质量浓度变化特征以及MDA质量浓度与PM2.5导致的DNA氧化性损伤之间的关系，对于了解当地PM2.5毒性具有重要意义，能够为PM2.5毒性评价和“一带一路”倡议地段大气污染研究提供科学依据。本研究以和田市城区2014年采集的大气PM2.5样品为实验对象，将PM2.5样品膜与2-硫代巴比妥酸和三氯乙酸混合显色液反应，用可见光分光光度计测定反应产物的吸光度，通过正交实验来优化PM2.5膜中MDA的提取及测定，并分析MDA质量浓度季节性分布特征和毒性。

1 实验部分

1.1 PM2.5样品的采集

采样点设在和田地区环保局(东经79°30′，北纬37°06′)四楼楼顶，采样高度为12 m，采样点距和田市城区主干道500 m，附近没有高层和污染源，该采样点能够代表和田市城区大气污染状况。采样仪器为武汉市某公司生产的智能大容量悬浮微粒采样仪(TH-1000型，流量为 1.05 m3/min)，用英国 Whatman 203 mm×254 mm石英纤维滤膜。样品采集于2014 年1月8—25日(冬季)、4月7—27日(春季)、7月2—26日(夏季)和10月15 日至11月11日(秋季)，采集样品个数分别为13、10、14、16个，总共53个样品。每期进行连续采样(除雨、雪天气之外)，单次样品采集时间为当天10:00至翌日08:00，连续采集22 h，同时记录气象参数。

采样前将石英纤维滤膜(英国)用铝箔纸包好置于马弗炉中，经 450 ℃高温灼烧5 h，除去膜上的有机物等污染物。采样前后的滤膜均恒温恒湿 [温度(20±2) ℃，相对湿度45%～55%)]48 h，以减少水蒸气的干扰。再进行称重，2次平行称重误差不超过0.01 mg时取平均值，采样前后膜的质量差即为所采集颗粒物的质量，根据采样体积计算出PM2.5的质量浓度。采样后用铝箔纸将膜包好装入密封袋置于冷冻柜(-18 ℃)中保存。

1.2 MDA测定实验

1.2.1 测定原理及标样的配制

测定MDA的实验原理：MDA与TBA(2-硫代巴比妥酸，规格25 g，上海)在酸性条件下发生反应，生成MDA-TBA红色复合物，MDA-TBA复合物在535 nm处有最大吸收峰，可通过比色法进行检测[15-17]。

实验用混合显色液的配制：准确称取TBA 2 g，用超纯水溶解并于棕色容量瓶定容至1 000 mL，配制0.2%的溶液；准确称取TCA(三氯乙酸，规格500 g，天津)200 g，用超纯水溶解并定容至1 000 mL棕色容量瓶中，配制20%的TCA溶液；再将2种溶液按体积比1∶1混合于棕色容量瓶中，备用[18]。

MDA标准储备液的配制：实验用TEP(丙二醛二甲缩醛，规格100 g，北京)作为标样，采用逐级稀释的方法配制0.25 μg/mL的TEP标准应用液。

样品的制备：剪取一定量载有PM2.5颗粒的石英纤维滤膜称重、剪碎，置入超纯水中，用超声波清洗器(KQ-250B，昆山)超声一定时间洗脱颗粒物，待用。

1.2.2 检出限及回收率

分别移取45 mL混合显色液于5支50 mL的具塞比色管中，再分别准确移取TEP标准应用液3、3.5、4、4.5、5 mL加入上述比色管中，用超纯水定容至50 mL刻度线，用90 ℃恒温水浴锅加热40 min，冷却至室温，在532 nm下测定其吸光值(可见光分光光度计，T6，北京)。在15～25 μg/L范围内，TEP的标准曲线方程为A=8.561C+0.037(r=0.999，式中A为吸光度，C为TEP质量浓度，μg/L)。在此范围内的加标回收率为89%～100%。

1.3 质粒 DNA 损伤评价实验

DNA评价法是一种定量测量PM2.5中活性氧对质粒DNA的氧化性损伤能力的体外方法，基本原理是颗粒物表面携带的自由基对超螺旋DNA产生氧化性损伤，最初的损伤引起超螺旋DNA松弛，进一步的损伤使DN线化。这种损伤变化引起 DNA在电泳仪中电泳淌度的变化，利用这一原理可以将不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中分离开来，然后使用灵敏的显像测密术测量线状的和松弛状DNA在所有DNA中占的比例，可得出颗粒物对质粒DNA氧化的程度[19-20]。实验过程在中国矿业大学煤炭资源与安全开采国家重点实验室(环境与健康实验室)完成。

2 结果与讨论

2.1 测定条件的优化

2.1.1 样品加热和超声先后顺序的确定

李娟等[21]研究了PM2.5对BEAS-2B细胞脂质过氧化损伤作用，发现加热和超声顺序会影响MDA的萃取率。因此，实验中分别称取约为0.1 g的膜，剪碎至25 mL混合显色剂中并摇匀。做两组实验，每一组3个样品。将其中一组具塞比色管放在超声波清洗器中超声40 min，再于90 ℃电热恒温水浴锅中加热40 min，取出后冷却静置12 h；另一组具塞比色管先放在90 ℃电热恒温水浴锅中加热40 min，再放在超声波清洗仪中超声40 min，取出后冷却静置12 h。分别取2组比色管的上清液10 mL于比色皿中，在波长532 nm下测其吸光度，求平均值，其结果见表1。由表1看出，先超声后加热所测样品的吸光度为0.160，大于先加热后超声所测样品的吸光度0.136，故选择先超声后加热作为最佳实验条件。

表1 超声和加热顺序对吸光度的影响Table 1 The influence on absorbance of ultrasonic and heating order

2.1.2 加热时间和超声时间的影响

有研究报道[22]，加热时间和超声时间影响样品中MDA提取效果。为了确定加热和超声时间，准确称取采样膜0.05 g左右，分别加入25 mL混合显色液，混匀。将5支具塞比色管放在超声波清洗器中超声，超声时间分别为20、30、40、50、60 min，在90 ℃电热恒温水浴锅中加热40 min，取出后冷却静置12 h。分别取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波长532 nm下测其吸光度，一个膜样测3次求平均值，测定结果见图1。超声时间不同所测样品的吸光度也不同，在超声时间为40 min时出现最高吸收峰。因此，本实验的超声时间最终选择40 min。

准确称取PM2.5采样膜，剪碎后放入具塞比色管中，分别加入25 mL混合显色液，混匀。将5支具塞比色管放在超声波清洗器中超声40 min，然后在90 ℃电热恒温水浴锅中加热，加热时间分别为30、35、40、45、50 min。取出后冷却静置12 h，分别取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波长532 nm下测定其吸光度，每个样品多次测定后取平均值。根据加热时间和所对应测定的吸光度绘图。从图1可知，加热时间为40 min时出现最大吸收峰。因此，取加热时间为40 min。

2.1.3 加热温度的影响

准确称取PM2.5采样膜5份(每份约0.05 g)，剪碎，分别再加入25 mL混合显色液，混匀。将5支具塞比色管放在超声波清洗器中超声40 min，分别在60、70、80、90、98.5 ℃条件下于恒温水浴锅中加热40 min。冷却静置12 h，分别取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波长532 nm条件下测其吸光度，一个膜样测3次，求平均值。从图2可知，样品的吸光度随着温度的上升而增大。但当水浴加热到90 ℃以上时，溶液中水的蒸发较为明显，溶质得到浓缩而使得溶液的吸光度剧增。为保证加热过程溶液的浓度基本保持不变且能得到较高的吸光度，确定加热温度为90 ℃。

图1 加热时间和超声时间对吸光度的影响Fig.1 The influence on absorbance of ultrasonic and heating time

2.1.4 显色剂用量对吸光度的影响

准确称取PM2.5采样膜5份(每份的质量约0.05 g)剪碎，于25 mL具塞比色管中分别加入15、25、35、45、50 mL混合显色液，混匀。超声40 min，在90 ℃加热40 min，冷却静置12 h，分别取5支比色管的上清液于10 mm比色皿中，在波长532 nm下测其吸光度，一个膜样测3次求平均值。由图2可以看出，显色剂用量在45 mL时出现最大吸收峰，之后趋于平稳。因此，确定显色剂的用量为45 mL。

图2 显色剂用量及加热温度的影响Fig.2 The influence on absorbance of chromogenic agent and heating temperature

2.2 和田市城区PM2.5中MDA浓度的季节性分布

在最佳测定条件下(超声40 min，在90 ℃水浴加热40 min，显色剂用量为45 mL，PM2.5样品膜质量为0.1 g)，采用三氯乙酸提取法测定了和田市城区总计53个PM2.5样品中的MDA含量，结果见图3。

从图3可以看出，4个季节PM2.5质量浓度由高到低的顺序依次为春季[602.12～1 591.70 μg/m3，平均值(1 096.67±369.60)μg/m3]、夏季[126.19～2 488.75 μg/m3，平均值(1 016.16±708.00) μg/m3]、秋季[231.48～1 771.48 μg/m3，平均值(686.88±525.0) μg/m3]、冬季[133.99～285.25 μg/m3，平均值(214.54±94.70)μg/m3]；MDA质量浓度夏季最高[1.52～7.75 ng/m3，平均值(4.43±1.90) ng/m3]，秋季[1.32～5.35 ng/m3，平均值(2.83±1.30) ng/m3]和冬季[2.12～4.02 ng/m3，平均值(2.82±0.80) ng/m3]相近，春季最低[1.09～1.93 ng/m3，平均值(1.43±0.20) ng/m3]，PM2.5和MDA质量浓度的变化趋势不尽相同。经分析，采样期间和田市城区夏季平均温度26.4 ℃，处于四季中的最高温度，有利于PM2.5中有机物在大气中进一步氧化和分解发生脂质过氧化反应。而春季虽然PM2.5的质量浓度最高，但是春季和田市大气平均湿度最低(10.7%)，平均风速最高(7.3 km/h)，均不利于大气污染物的化学转化过程。

2.3 MDA的体外氧化损伤能力

MDA具有一定的致癌作用[4]，因此将所测得的PM2.5的水样和全样的TD30(造成DNA30%损伤所需剂量)与相应样品中MDA的质量浓度进行了线性回归分析，结果如图4所示(n=19)。由图4可以看出，无论是全样还是水样的TD30均随MDA浓度的增加而降低，而且全样的TD30值与MDA呈显著负相关(r=-0.597，显著性P<0.01)。表明PM2.5中的MDA具有一定的氧化损伤，而全样的氧化损伤更为显著。因MDA是脂质过氧化的最终产物，又是细胞受损伤的标志，其本身又会对细胞造成一定伤害[23-24]。所以，随着MDA质量浓度的升高，造成DNA30%损伤所需要的剂量呈下降趋势。