蛋白酶体抑制剂MG132对急性髓系白血病细胞增殖与凋亡的影响

2019-03-13郑晓辉黄家福徐淑娟许雅苹房纯正翁乐斌黄黎月

中国药理学通报 2019年3期

郑晓辉，黄家福，徐淑娟，李鑫，许雅苹，房纯正，翁乐斌，汪洁，黄黎月

(1. 厦门医学院基础医学部生理学教研室，机能与临床转化福建省高校重点实验室,福建厦门 361023；2. 福建医科大学附属协和医院血液科,福建福州 350001；3. 厦门医学院基础医学部病理学教研室,福建厦门 361023)

黏附调节分子1(adhesion regulating molecule 1, ADRM1)亦被称为 hRpnl3(human Rpn13)。ADRM1基因位于20号染色体长臂13区(20q13)上，包含9个外显子，可转录成两个转录本，编码同一种蛋白ADRM1。研究者在对多细胞真核生物内ADRM1的保守性分析中发现ADRM1高度保守，说明 ADRM1可能在生命过程中发挥重要功能[1-2]。研究显示，ADRM1蛋白是26S蛋白酶体亚单位19S调节颗粒上一个受体[3-4]，决定26S蛋白酶体结构不对称性[5]。它分为3个功能性区域：N-端、C-端和插入片段。ADRM1通过N-端结合到19S调节颗粒的Rpn2和Rpn10亚基上，而通过C-端尾9个α螺旋与泛素羧端水解酶37(ubiquitin carboxy-terminal hydrolase 37, UCH37)上卷曲螺旋的C-端相互作用，募集UCH37到蛋白酶体上，并将其活化，形成 ADRM1/UCH37复合物，进入蛋白酶体泛素化路径，介导NF-κB、TGF-β I型受体、诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)等底物蛋白的降解[6-8]。

已有研究表明[9-12]，ADRM1在结肠癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌等多种恶性肿瘤中处于过表达状态，是驱动20ql3区基因高拷贝扩增的主要基因。本实验组前期研究发现，ADRM1基因在裸鼠体内不同致瘤率HL60细胞内存在表达差异(≥2倍)，在急性白血病(acute leukemia, AL)细胞中表达上调[13]。因此，本实验首先通过了解ADRM1在实验室白血病细胞株中表达；其次，观察ADRM1干扰后HL60细胞增殖变化；最后，鉴于蛋白酶体抑制剂是临床多发性骨髓瘤(multiple yeloma, MM)常用药，效果明显；MG132(结构见Fig 1)也称Z-LLL-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-CHO、Z-Leu-Leu-Leu-al或Carbobenzoxy-L-leucyl-L-leucyl-L-leucinal，是一种常用的蛋白酶体抑制剂，可抑制泛素蛋白酶体途径活性，上调caspase-3表达，诱导肝癌细胞HepG2凋亡[14]，本实验拟通过观察HL60、NB4细胞在不同浓度MG132作用下增殖与凋亡，同时检测HL60细胞内ADRM1、UCH37蛋白表达，了解ADRM1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中的作用。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1临床标本 AL患者初治骨髓标本(AL-untreated)、AL患者完全缓解骨髓标本(AL-complete remission, AL-CR)、脐带血标本来自2010年9月至2014年5月期间，福州协和医院门诊和住院收治患者。确诊根据FAB分型及张之南《血液病诊断及疗效标准》。以上样本经患者书面知情同意获得，并经中华医德委员会和福建医科大学联合医院信托基金批准使用。

Fig 1 Chemical structure of MG132

1.1.2细胞株人急性早幼粒细胞白血病细胞NB4、人急性单核细胞白血病细胞THP1、人B淋巴细胞白血病细胞 Ball、人急性T淋巴细胞白血病细胞Jurkat、人急性淋巴母细胞性白血病细胞Molt-4、人慢性髓系白血病细胞K562、人多发性骨髓瘤细胞U266、人组织细胞淋巴瘤细胞U937，由福建省血液病重点实验室馈赠；人急性粒细胞白血病部分分化型细胞 HL60，购自上海富衡细胞公司；大肠杆菌E.coli DH5α、293T细胞为本实验室保存。

1.1.3试剂人淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)；TRIzol reagent(Invitrogen公司)；逆转录试剂盒(Promega公司)；Oligo Primers(上海生工)；SYBR Green Master(ROX)(Roche公司)；酶切酶、连接酶(NEB)；质粒抽提试剂盒(碧云天)；MG132(Sigma)；CCK-8(Yeasen)；Annexin V FLUOS Staining Kit(Roche)；Western blot 抗体(CST公司)；CD34+抗体(BD)。

1.1.4仪器二氧化碳细胞培养箱2323-2(SHELLAB公司)；倒置显微镜37XA(上海光学仪器厂)；流式细胞分选仪FACS Aria(美国BD 公司)；荧光倒置显微镜DMLB(德国徕卡公司)；Gene Amp 2400 PCR 扩增仪、实时荧光定量PCR仪7500(美国应用生物系统公司)；流式细胞仪EPICSXL(贝克曼库尔特公司)；电泳仪PowerPac HC(Bio-Rad公司)；快速Westrn blot仪器MA01821(Millipore)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR法检测CD34+AL细胞、造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)、AL-CR标本、血液肿瘤细胞株内ADRM1 mRNA表达 TRIzol抽提细胞内RNA，于1%琼脂糖电泳分离，EB染色,在紫外光透射仪中观察，拍照28 S RNA和18 S RNA ，确定其比值。当28 S/18 S约为2 ∶1时，说明RNA稳定并且无降解，逆转录试剂盒说明合成cDNA，用于实时定量PCR实验。利用DNAMAN软件设计引物，由上海英骏生物技术有限公司及上海生工公司合成，引物序列如下：ADRM1上游引物5′-AAGCGGAAAGGGCTGGTGTA-3′，下游引物5′-GCAATGCTCCTCATCCTGGT-3′，扩增片段长度240 bp；以β-actin为对照基因，其上游引物5′-AGTGTGACGTGGACATCCGCAA-3′，下游引物5′-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3′，扩增片段长度220 bp。

1.2.2构建ADRM1 shRNA与scrambled shRNA慢病毒感染HL60细胞利用DNAMAN软件，与上海吉玛公司(Genepharma)共同设计并合成有效siRNA干扰序列3条及阴性对照序列1条，利用Lipofectamine 2000瞬时转染HL60细胞，qRT-PCR法筛选最有效干扰序列。上海吉凯公司合成靶序列(ADRM1-shRNA)及阴性对照序列(scrambled shRNA)相应各1对单链DNA，退火合成双链 shDNA，经酶切连接到带GFP筛选标记的慢病毒干扰载体GV115上，之后通过CaCl2沉淀法转导到感受态DH5α内，进行质粒扩增，之后质粒抽提试剂盒抽提质粒，经双酶切鉴定后，送上海英骏生物技术有限公司测序，得到ADRM1 shRNA与scrambled shRNA慢病毒干扰载体。由上海吉凯基因化学技术有限公司包装成ADRM1 shRNA与scrambled shRNA慢病毒，并进行病毒滴度浓缩。慢病毒感染HL60细胞，流式细胞分选仪分选GFP阳性HL60细胞，多次流式筛选，得到稳定ADRM1 shRNA与scrambled shRNA HL60细胞株。

1.2.3细胞增殖/毒性实验在96孔板中接种100 μL 细胞悬液(细胞增殖实验5×107·L-1；细胞毒性实验1×108·L-1)，于37 ℃、5% CO2培养箱预培养24 h；向培养板加入10 μL不同浓度的MG132，孵育24、48、72 h后，向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，在培养箱内孵育3 h；用酶标仪测定在450/630 nm处的吸光度。

1.2.4Annexin V FLUOS Staining Kit流式细胞术检测细胞凋亡用 Annexin V FLUOS Staining Kit检测细胞凋亡率。收集细胞于5 mL PBS中，800 r·min-1离心5 min，弃上清，预冷的PBS洗2次，之后按说明书操作。

1.2.5Western blot检测细胞内蛋白表达收集各组细胞，PBS洗2次，加入RIPA细胞裂解液(含1 mmol·L-1PMSF、1 mmol·L-1正钒酸钠、10 mg·L-1抑肽酶)提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，取40 μg总蛋白进行Western blot实验。10% SDS-PAGE电泳后，行转膜印迹，分别用β-actin、ADRM1、UCH37一抗体与膜上的抗原结合，然后用HRP偶联的二抗与其反应，用ECL化学发光试剂检测，经压片曝光后，显影和定影。比较各组蛋白表达情况。

2 结果

2.1ADRM1mRNA在血液肿瘤细胞株的表达以急性白血病完全缓解患者骨髓标本(AL-CR)、脐带血干细胞标本(HSCs)为对照，结果如Fig 2所示：急性白血病初治患者骨髓标本(AL-untreated)、急性白血病初治患者骨髓 CD34+细胞标本(CD34+AL cells)、急性髓系白血病细胞株(NB4、THP1、HL60)、急性淋系白血病细胞株(Ball、Molt-4、Jurkat)、慢性髓系白血病细胞(K562)、组织细胞淋巴瘤细胞 U937与多发性骨髓瘤细胞(U266)内，ADRM1 mRNA表达明显上调；实验室细胞株内ADRM1表达普遍高于急性白血病初治患者骨髓标本内 ADRM1 表达。

Fig 2 Comparison of expression of ADRM1 mRNA in blood tumor cell lines

RQ=2-ΔΔCT

2.2qRT-PCR筛选有效靶序列qRT-PCR法检测siRNA瞬转后，HL60细胞内ADRM1 mRNA表达水平，以分析不同靶序列siRNA的干扰有效性。HL60细胞RNAi 48 h后，β-actin与ADRM1基因的qRT-PCR结果见Tab 1。353靶点siRNA沉默有效率约0.67(有效率=1-2-ΔΔCT)，1044靶点siRNA则为0.49，所以选择353靶点siRNA设计shRNA。

Tab 1 Expression of ADRM1 mRNA in HL60 after transient transfection of siRNA 48 h(2-ΔΔCT)

2.3成功构建慢病毒干扰载体LV-ADRM1-shRNA载体：TGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTG ACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGT TTTAAAATTATGTTTTAAATGGACTATCATATGCTTA CCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATA TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGGGTCTAC GTGCTGAAGTTCACTCGAGTGAACTTCAGCACGTAG ACCCTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGT GGATAACCGTATTACCGCCAGGCATTAGTTATTAAT AGTAATCAATTAGGGGGTCATTAGTTCATAGCCCAT ATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTAACGGAAAATG GCCCGCCTGGCTGATCGCCCAACGACCCCCGCTCAT TGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGGAACGC CAATAGGCCCTTTCCATTGGGGTCAATGGGTGGAGT ATTTACGGGTAAACTGCC；LV-scrambled-shRNA载体：GGCTTAATGTGCGATAAAAGACAGATAATCTG TT CTTTTTAATACTAGCTACATTTTACATGATAGGC TTGGATTTCTATAACTTCGTATAGCATACATTATACG AAGTTATAAACAGCACAAAAGGAAACTCACCCTAA CTGTAAAGTAATTGTGTGTTTTGAGACTATAAATAT CCCTTGGAGAAAAGCCTTGTTTTTCTCCGAACGTGT CACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTT TTTCTCGAGTACTAGGATCCACGCGAATTAATTCTG TGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCA GGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCA TCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCC AGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGC ATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAA CTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGC CCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAA。

2.4成功构建ADRM1shRNA与scrambledshRNAHL60细胞由上海吉凯公司包装慢病毒及滴度测定。慢病毒感染HL60细胞，MOI值为病毒滴度/接种细胞数。慢病毒感染有效率受MOI值、细胞状态、细胞接种密度、营养状态、培养条件、有无助转剂及其浓度的影响。我们在优化HL60细胞感染条件后，采用不同 MOI值，GFP表达效率也不同，两者之间不呈正比(Tab 2)；普遍认为GFP表达效率与慢病毒感染有效率呈正相关。

Tab 2 Effective rate of lentivirus infection in different MOI values

慢病毒对细胞也有一定的毒性作用，所以我们以MOI小于75的病毒量感染HL60细胞(Fig 3)，再采用流式细胞分选仪分选出GFP阳性细胞，即为慢病毒成功感染的HL60细胞。分选时分析观察10 000个细胞，首先以侧向光散射(side scatter，SSC)和前向光散射(forward scatter，FSC)设门。去除死细胞，圈选大小比较均一的活细胞群设门为P1；P1门内细胞以SSC和GFP再设门。以野生株HL60细胞(parental)为对照，其P1内细胞为GFP阴性，不分群，设门为P2(Fig 4B)。慢病毒感染的HL60细胞，P1内细胞分两群(Fig 4D)，P2门外右为GFP阳性细胞，圈选该GFP阳性细胞群并设门为P3。P3内细胞即为慢病毒成功感染的HL60细胞。我们收集该P3细胞群。

Fig 3 Detection of lentivirus infection in HL60 cells(MOI=75,×100)

The photo on the left side is under the ordinary light microscope, while the right side under the fluorescence microscope. A, B: Scrambled shRNA;C,D:ADRM1 shRNA.

Fig 4 Sorting of GFP positive HL60 cells

A,B:Parental HL60 cells;C,D:HL60 cells infected with lentivirus carrying GFP fluorescence

2.5ADRM1shRNA、scrambledshRNA、parentalHL60细胞内ADRM1蛋白的表达Fig 5的Western blot结果显示，ADRM1 shRNA组细胞内ADRM1蛋白表达明显下调；scrambled shRNA和parental HL60细胞内ADRM1蛋白表达未见明显差异。提示成功构建ADRM1干扰HL60细胞及其阴性对照株。

Fig 5 Expression of ADRM1 protein in ADRM1 shRNA, scrambled shRNA and parental HL60 cells

2.6ADRM1干扰前后HL60细胞增殖情况CCK-8法检测parental、scrambled shRNA和 ADRM1 shRNA各组细胞增殖情况。如Fig 6所示，ADRM1 shRNA组细胞增殖缓慢，说明下调ADRM1抑制HL60细胞增殖。

2.7MG132对HL60细胞活力的影响CCK-8法检测蛋白酶体抑制剂 MG132(0、0.1、0.25、0.5、0.8、1、1.5 μmol·L-1)作用24 h，对 parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60细胞的影响。如Fig 7所示，MG132抑制parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA HL60 细胞活力，随着MG132浓度提高各组细胞死亡增加；各组细胞在OD 450/630值相近(即0.15左右)，所需的MG132浓度分别为0.5 μmol·L-1(parental组)、0.8 μmol·L-1(scrambled shRNA组)和1.5 μmol·L-1(ADRM1 shRNA组)，说明ADRM1下调前HL60细胞对MG132敏感性较高，反映MG132对HL60细胞的毒性作用与HL60细胞内ADRM1蛋白水平相关。

Fig 6 Cell growth of parental, scrambled shRNA

Fig 7 Cell viability of parental, scrambled shRNA and ADRM1 shRNA groups treated with different MG132 concentrations for 24 h

2.8MG132对HL60细胞内ADRM1、UCH37蛋白表达的影响为探讨蛋白酶体抑制剂 MG132抑制细胞增殖、降低其活力的作用与ADRM1的相关性，利用Western blot检测 0.25、0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental、scrambled shRNA和ADRM1 shRNA组细胞内ADRM1、UCH37蛋白表达变化。如Fig 8所示，0.4 μmol·L-1MG132作用24 h后，parental 和scrambled shRNA组细胞内ADRM1、UCH37蛋白表达减少；ADRM1 shRNA组ADRM1 蛋白表达提高，UCH37蛋白下调。0.25 μmol·L-1MG132作用下的parental HL60细胞UCH37 蛋白表达提高。0.4 μmol·L-1MG132作用后，ADRM1 shRNA组细胞ADRM1蛋白表达提高，0.25 μmol·L-1MG132作用下，parental组细胞UCH37蛋白表达提高，可能是各组细胞对低浓度MG132应激性反应，具体机制有待进一步研究。

2.9MG132促进HL60、NB4细胞凋亡细胞以1×105·L-1接种6孔板2 mL，设不同浓度 MG132实验组，各组2个复孔，24 h后流式细胞术检测各组细胞凋亡，独立重复实验2次。图左上(upper left, UL)为死亡细胞，右上(upper right, UR)为晚期凋亡细胞，左下(lower left, LL)为活细胞，右下(lower right, LR)为早期凋亡细胞。如Fig 9、10所示，随着MG132 浓度提高，细胞早期与晚期凋亡均增加。以MG132浓度为0.4 mol·L-1时HL60凋亡率为参照，当MG132浓度为0.8 μmol·L-1时HL60细胞早期凋亡变化较小，晚期凋亡大量增加；而MG132浓度为2 μmol·L-1时NB4细胞凋亡率，处于HL60细胞MG132浓度为0.25 μmol·L-1与0.4 μmol·L-1之间。以上结果说明NB4细胞对MG132敏感性小于HL60细胞，提示不同白血病亚型细胞株对 MG132药物反应存在个体差异。

3 讨论

ADRM1 mRNA在9株实验室血液肿瘤细胞中过表达，这与前述研究ADRM1在多种肿瘤中过表达情况一致，说明ADRM1可能参与血液肿瘤，特别是AL的发生发展。

ADRM1干扰前后HL60细胞在0.5 μmol·L-1MG132作用下，parental组活力下调72%，scrambled shRNA组下调42%，而ADRM1 shRNA组下调30%，提示ADRM1表达高的肿瘤细胞对MG132敏感，受抑制明显；随着 MG132浓度提高，HL60细胞增殖缓慢、活力下降，此时各实验组细胞内ADRM1、UCH37蛋白表达减少，说明MG132下调ADRM1、UCH37蛋白表达，抑制HL60细胞增殖与活力；HL60、NB4细胞随MG132浓度提高凋亡亦明显增加。以上研究为临床治疗AML采用抑制ADRM1表达手段提供了理论基础。

*P<0.05vsparental 0 group;#P<0.05vsscrambled shRNA 0 group;ΔP<0.05vsADRM1 shRNA 0 group

特定基因的mRNA丰度不一定与其翻译产物——蛋白质的表达量成线性关系，因为基因表达成蛋白的调控层次包括转录水平的调控、转录后调控、翻译水平调控及翻译后调控。此外，mRNA的降解、蛋白的降解、修饰折叠等因素都可能导致mRNA丰度与蛋白表达水平不一致。因此，可以出现ADRM1 mRNA水平较HL60高的NB4细胞凋亡所需MG132浓度较高的现象。

恶性肿瘤细胞具有自主生长、过度增殖、对抑制生长的调控信号不敏感、逃避细胞内在的凋亡信号、促血管生成、侵袭性生长及转移的能力。恶性肿瘤的发生往往是单克隆肿瘤细胞增殖失控、凋亡受阻的结果。已有研究表明，ADRM1通过募集UCH37形成ADRM1/UCH37复合物，介导NF-κB的降解，并影响其活性，参与细胞周期和凋亡过程。这提示ADRM1在肿瘤中作用的发挥可能与UCH37及NF-κB信号通路有关。UCH37可通过影响Bax/Bcl-2比率和caspase-9、 caspase-3酶活性而抑制细胞凋亡。NF-κB与恶性肿瘤发生发展过程有着极为紧密的关系，对绝大多数恶性肿瘤具有促癌作用。静息状态的细胞，NF-κB位于胞质中，与IκB形成复合物。当该复合物被激活时，NF-κB暴露核定位位点，进入核内与特异性κB序列结合，启动下游靶基因转录和表达。NF-κB主要调节炎症和自身免疫反应，也可调控细胞周期及凋亡，影响细胞分化，可控制细胞增殖及癌变。研究表明，NF-κB转录因子可通过与Cydin D1的启动子κB 位点结合而启动该基因的转录，也可通过其他途径间接上调Cyclin D1的表达。亦有研究显示，NF-κB可通过激活Cyclin D2、Cyclin D3、Cyclin E和c-myc的转录和表达，促进淋巴瘤细胞的细胞周期转化和增殖。NF-κB通路的异常激活，可导致一系列细胞肿瘤相关基因的异常表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡、促进其增殖。因此，ADRM1可能通过UCH37改变Bax/Bcl-2比率和caspase-9、caspase-3酶活性，抑制HL60细胞凋亡；也可能通过ADRM1/UCH37复合物影响NF-κB的降解或活性，促进细胞周期调控蛋白的表达，使细胞周期加速通过G0/G1期，促进细胞增殖，从而在白血病的发生发展中发挥作用。因此，本研究为临床治疗AML采用下调ADRM1表达策略提供了依据[4-6,8,14-15]。

Fig 9 Apoptosis of HL60 cells treated with different concentrations of MG132 for 24

A,B, C, D: Apoptosis of HL60 cells exposure to 0, 0.25, 0.4 and 0.8 μmol·L-1MG132 for 24 h; E:Early and late apoptotic rate of HL60 cells.*P<0.05vs0 group