利用MALDI-TOF MS特异质量峰对耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌同源性的快速分型

余佳佳,刘婧娴,李媛睿,刘 瑛

(上海交通大学医学院附属新华医院检验科，上海 200092)

耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae, CRKP)是近年来受到广泛关注的多重耐药菌。2014年CHINET数据显示，CRKP的检出率达10%[1]，我院2017年耐药监测数据显示CRKP的检出率已高达30%，呈现逐年增长的趋势，对临床抗感染治疗带来极大挑战，对患者的生命安全带来极大威胁。流行病学分析是监测感染暴发以及控制医院感染的重要手段。近年来，随着基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技术的不断发展，越来越多的研究[2-3]表明，MALDI-TOF MS在流行病学领域有较好的应用前景。利用MALDI-TOF MS进行流行病学分析，方法主要包括直接利用质谱仪器中配套的软件进行主成分分析(principal component analysis, PCA)和核心图谱(main spectra profile, MSP)聚类分析[4-7]，以及对质量图谱进行特异质量峰筛选后再用于分型[8-9]。文献报道，PCA聚类分析和MSP聚类分析可以鉴别区域流行[10-13]以及暴发感染的菌株[14-16]，但其分型效果与多位点序列分型(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等分子分型结果符合度较差。对质量图谱进行特异质量峰筛选后再进行聚类分析，可与分子分型结果达到较高的符合率[17-18]。而目前通过筛选特异质量峰进行分型的方法主要用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)的分子流行病学研究，而针对CRKP的研究目前还较少。本研究旨在建立一种方法——利用MALDI-TOF MS质量图谱中的特异质量峰对CRKP进行快速同源性分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 选取上海交通大学医学院附属新华医院微生物实验室前期收集并已进行MLST的69株CRKP，复旦大学附属华山医院惠赠的7株CRKP，共76株，其中52株用于特异质量峰分型方法的建立，24株用于特异质量峰分型方法的验证。

1.1.2 试剂与仪器 甲酸和乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司，HCCA基质和标准蛋白校准品(protein calibration standard Ⅰ)购自德国Bruker Daltonik公司，血平板、麦康凯平板购自上海伊华生物技术有限公司。电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司，低速常温离心机购自上海菲恰尔分析有限公司，MicroflexTM LT型质谱仪、96孔金属靶板、Flex control 3.0软件、MicroFlexTM Biotyper 3.0鉴定分析软件、Clinpro Tools 3.0软件以及Flex analysis 3.0图谱分析软件均购自德国Bruker Daltonik公司，Mastercycler EP Gradient Thermal Cycler PCR仪和微量移液器购自德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 特异质量峰分型方法的建立

1.2.1.1 不同ST型别CRKP质量图谱的获取 选取52株CRKP，共包括25个序列型(Sequence Type, ST)，分别为ST11(6株)、ST520(6株)、ST48(6株)、ST37(5株)、ST423(3株)、ST323(3株)、ST14(2株)、ST65(2株)、ST846(2株)、ST2168(2株)、ST29、ST76、ST147、ST278、ST438、ST478、ST571、ST1696、ST1721、ST1722、ST1723、ST1725、ST2169、ST2170和ST2171各1株。从-80℃冰箱取出保存菌种进行复苏，接种至麦康凯平板，35 ℃孵育过夜后取单个菌落转种血平板，再次35 ℃孵育过夜，然后进行MALDI-TOF MS分析：每株菌取3个单菌落分别加入到70%乙醇中，13 000 r/min离心5 min，去掉上清后加入5 μL甲酸∶乙腈(1∶1)裂解液，裂解后取1 μL加入96孔金属靶板中，自然干燥后，加1 μL基质α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix, HCCA)，干燥后进行检测。校准品是标准蛋白校准品，参数设计m/z 2000-20000，shots:200，激光强度80%，每一个靶孔上在不同的位置获取3个图谱，则每株菌有9个质量图谱，将图谱进行软件分析鉴定，当鉴定分数大于2.30时认为该菌株被准确鉴定至种水平，保存图谱。将所有图谱导入flexanalysis 3.0软件，将质量图谱中所有质量峰的基底拉至最低水平线，并对曲线进行光滑处理。

1.2.1.2 特异质量峰的筛选 本实验共包含25种ST型别CRKP，将所有菌株图谱进行分组，从而筛选出每种ST型别CRKP的特异质量峰，具体流程为：所有CRKP质量图谱分成ST11型和非ST11型(包括除ST11型外的其他所有ST型)，两组图谱分别导入Clinpro Tools 3.0软件，通过软件统计学分析，获得两组间质量峰的比较分析结果。同样的方法将所有菌株图谱分成ST520型和非ST520型(包括除ST520型外的其他所有ST型)，再次将两组图谱分别导入Clinpro Tools 3.0软件，通过软件统计学分析，获得两组间质量峰的比较分析结果，以此类推获得25个ST型的比较分析结果。然后根据分析的主要因素信噪比(signal/noise，S/N)，即细菌质量峰信号强度和机器自身产生噪声的比值；变异系数(coefficient of variation, CV)，即质量峰强度在同一组细菌当中的离散程度；S/N比值，即不同分组间，质量峰信噪比的比值，通过以上3个主要因素制定特异质量峰筛选的标准。参照国外文献中筛选特异质量峰的方法(S/N≥5，S/N比值≥2)[8]，设置5个不同的特异质量峰挑选标准，并按照不同的标准筛选各个ST型特异质量峰。标准1：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；标准2：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%；标准3：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤50%；标准4：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤50%；标准5：(1)S/N≥5，(2)S/N比值≥2，(3)CV≤40%。

1.2.1.3 最佳标准的确定 利用1.2.1.2中5个标准筛选得到的特异质量峰对52株CRKP中的29株菌(只选取包含3个或3个以上菌株的ST型别)进行分型，菌株ST型别包括ST11、ST37、ST48、ST520、ST323和ST423，将这29株菌的图谱导入flexanalysis 3.0软件，对所有S/N值>4的质量峰进行挑选，若无特异质量峰(S/N<4)，则赋值为0；若有特异质量峰(S/N>4)，则赋值为1；若特异质量峰S/N>10，则赋值为2。将获得的数字信息导入SPSS软件中，通过最远邻元素聚类分析方法进行聚类，并与MLST结果进行比较，将与MLST结果符合率最高的标准确定为最佳标准。

1.2.2 特异质量峰分型方法的验证 另挑选24株包含5种常见ST型别的CRKP，分别为ST11(7株)、ST48(6株)、ST520(5株)、ST37(4株)以及ST423(2株)，对特异质量峰分型方法进行验证。按照1.2.1.1的步骤获取质量图谱，按照最佳标准挑选出的特异质量峰对24株CRKP的图谱进行分析并赋值，将获得的数字信息导入SPSS软件中，通过最远邻元素聚类分析方法进行聚类，并与MLST结果进行比较。

1.2.3 分型方法的比较 MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0软件可根据菌株质量图谱对菌株进行聚类分析，包括PCA聚类分析和MSP聚类分析，本研究利用这两种方法同时对上述用于验证的24株CRKP进行分型，并将其结果与特异质量峰分型方法结果进行比较分析。

2 结果

2.1 特异质量峰分型方法的建立 按照标准2，共筛选出45个特异质量峰。按照特异质量峰，对29株CRKP质量图谱的质量峰进行赋值并获得数字列表。将数字导入SPSS软件中，通过最远邻元素的聚类分析方法获得分型结果，见图1。图中黑色粗竖线(距离约为12)将31株CRKP分成7组，其中5株菌分组不符，分别为ST37-KP174、ST37-KP55、ST520-KP164、ST48-KP236和ST48-KP227，其余24株CRKP分型结果与MLST一致，符合率为82.8%(24/29)。按照标准1、标准3、标准4和标准5挑选出的特异质量峰分型结果与MLST结果的符合率分别为72.4%、72.4%、72.4%和75.9%。综合分析发现，按照标准2得到的质量峰分型效果最好，故确定标准2为最佳标准。

2.2 特异质量峰分型方法的验证 将另外24株CRKP质量图谱导入Flexanalysis 3.0软件中，对基于标准2筛选出的45个质量峰进行分析并赋值后导入SPSS软件，通过最远邻元素聚类分析方法获得分型结果(图2)。按照标准2的验证结果在距离为12处(黑色粗竖线)将24株CRKP分成5组，与MLST结果(ST11、ST37、ST48、ST423和ST520)一致，其中有4株CRKP分类结果与MLST结果不符，ST11-KP361、ST520-KP221、ST520-KP214和ST48-KP246和ST37型菌株分在同一组。该方法与MLST结果的符合率达83.3%。

注：KP为新华医院菌株编号，JS为华山医院菌株编号

图2 24株验证菌株特异质量峰分型的聚类分析结果

2.3 分型方法的比较 利用MALDI-TOF MS中的Clinpro Tools 3.0和MALDI Biotyper 3.0对24株CRKP进行PCA聚类分析和MSP聚类分析。PCA聚类分析结果显示，有8株细菌分组不符，其余16株CRKP分为5组，与MLST结果的符合率为66.7%。MSP聚类分析结果与MLST结果一致性较差，没有明显符合ST型的分组趋势。见图3、4。

图3 Clinpro Tools 3.0软件对24株CRKP进行PCA聚类分析的结果

图4 MALDI Biotyper 3.0软件对24株CRKP进行MSP聚类分析的结果

3 讨论

目前，常用的分子流行病学方法主要有PFGE分型和MLST[19]。PFGE分型是通过限制性内切酶将基因组切割后进行脉冲场电泳分析，根据条带的不同对菌株进行分型，该方法是分子流行病学分析的金标准[20]，但是操作较为繁琐，需要特殊的仪器设备和专业的操作人员，不宜在实验室常规开展；MLST是基于管家基因序列进行分型的方法，通过PCR扩增管家基因后对扩增产物进行测序，测序结果经比对后获得菌株的ST型别[21]，该方法原理简单，操作方便，但耗时较长，成本较高，难以对大样本量的菌株进行快速分析。而利用MALDI-TOF MS进行流行病学分析的方法不需额外的费用和复杂的操作，快速、简便，通过对质量图谱进行分析便可获取流行病学信息，为医院感染防控和感染暴发监测提供依据。

利用MALDI-TOF MS技术获得的质量图谱中包含大量质量峰信息，可直接用于流行病学分析，但同时也存在不足，其中噪声、重复性低、不稳定的质量峰，以及种属特异的质量峰等都会对分型结果造成影响，因此，利用质量图谱进行亚型区分时应先按照一定的标准进行特异质量峰的筛选，并根据筛选出的特异质量峰进行后续的分型。S/N是特异质量峰信号与噪声的比值，比值越高表示特异质量峰的强度越高，说明特异质量峰对应的是某种菌株蛋白而非机器噪声。CV是变异系数，是指该特异质量峰在同一ST型别多个菌株多个质量图谱中出现的稳定性，CV值越小表明质量峰越稳定。S/N比值是某ST型菌株特异质量峰与其他ST型菌株的同一m/z特异质量峰的信噪比的比值，S/N比值越高，表明特异质量峰与ST型的相关性越好。本研究根据S/N、CV系数及S/N比值设置了特异质量峰的5个筛选标准，并确定最佳标准为：(1)S/N≥4，(2)S/N比值≥1.5，(3)CV≤40%，按照此标准共挑选出45个特异质量峰，利用这些特异质量峰对24株CRKP进行分型，结果与MLST的符合率达83.3%，表明该方法具有较好的分型潜力。

特异质量峰分型方法是在菌株鉴定图谱的基础上，通过观察特异质量峰，并根据特异质量峰强度进行的聚类分析。与PCA聚类分析和MSP聚类分析相比，该方法准确率高，排除了质量图谱中CRKP种特异性质量峰的干扰，从而提高了对CRKP亚型区分的能力。与MLST等分子分型的方法相比，该方法不需要额外的成本，更加快速、简便。在建立方法的基础上，实验人员只需获得菌株的鉴定图谱，即可通过分析获得聚类结果，适合在临床微生物室常规开展。本研究进行特异质量峰筛选时共选取了25个ST型的CRKP，并筛选出每个ST型的特异质量峰，当其中任何一种ST型发生暴发流行时，可通过筛选的特异质量峰将暴发流行的菌株进行聚类，从而快速获悉其流行状况。

利用MALDI-TOF MS菌株图谱中特异质量峰进行细菌分型的方法也存在一定局限性，本研究包括CRKP的ST型别有限，但全球流行的ST型别多种多样，特异质量峰的筛选只针对本实验室中包含的ST型别，所以筛选出的特异质量峰只能对这些亚型进行有效区分，而无法判断是否能区分其他亚型。由于本实验中收集的存在流行趋势CRKP的ST型较为局限，主要为ST11、ST520、ST37、ST48以及ST423，其他ST型CRKP菌株数量较少，无法用于特异质量峰分型的验证，因此后续研究中需要继续收集各ST型的CRKP，对该方法进行验证。由于质量峰容易受菌株培养条件，孵育时间以及操作手法等影响，而本试验室目前只是对特异质量峰分型的方法做了初步的探索，建立方法时设置的各项参数可能只适合于本试验室，因此，其他实验室利用MALDI-TOF MS质量峰进行深入分析时，应建立适合自己实验室的标准，设置相应的参数，保证试验的准确性和可重复性。

本研究初步显示，MALDI-TOF MS在医院感染流行病学分析领域具有较大的应用潜力。随着数据库的不断完善，软件的日益更新，MALDI-TOF MS有望在不久的将来应用于临床微生物实验室进行快速同源性分析，为暴发流行的监测和医院感染的控制提供依据。