基于水溶性聚合物纳米粒荧光猝灭测定Cu(Ⅱ)

潘 宇, 覃小宁, 石柏煊, 梁淑彩*, 鄢国平

(1.武汉工程大学材料科学与工程学院，湖北武汉，430074; 2.武汉大学药学院，湖北武汉 430072)

铜是自然界大量存在的一种金属元素，也是人体必需的微量元素，在维持核酸、蛋白质等生物大分子的基本结构，保证生命体正常功能运作方面起着至关重要的作用。但机体对于细胞内Cu(Ⅱ)的含量有着十分严格的调控机制，人体中过量Cu(Ⅱ)的存在会引起中毒及导致各种疾病，如肾损伤、阿尔兹海默症、威尔逊氏病等[1 - 2]。随着冶金、电子工业的发展，产生了大量的含铜废水，易于导致铜在生物及环境中聚集，而对环境及食品样品中的Cu(Ⅱ)进行检测，可以有效避免Cu(Ⅱ)过量对人体造成伤害。近些年来，借助于荧光探针对Cu(Ⅱ)进行荧光传感分析的方法因灵敏度高、操作简单、费用低及能够实时分析等优点而受到关注。目前，已有大量基于小分子荧光团和纳米粒子(如贵金属纳米簇、碳纳米粒、无机半导体量子点等)的荧光探针对Cu(Ⅱ)分析测定的报道[3 - 8]。但这些方法大多需要使用有机溶剂，且部分方法还存在探针合成复杂、灵敏度及选择性不高等缺陷，使它们的应用受到一定限制。因此，具有良好水溶性的Cu(Ⅱ) 荧光探针的研究仍然是Cu(Ⅱ)分析检测领域的重要任务。

聚合物荧光纳米材料在材料科学领域扮演着十分重要的角色，其具有结构多样性、功能可设计性、生物相容性好等显著优势，是一类有着广泛应用前景的功能材料，作为荧光探针的研究和应用已经受到关注，但目前相关报道还不多[9 - 12]。我们在对N-氨基-4-N-甲基哌嗪-1,8-萘酰亚胺(AMN)接枝聚丙烯酸形成的聚合物纳米粒(PAAMN)与金属离子的传感测试中发现，在水相中及生理pH条件下，微量Cu(Ⅱ)能使PAAMN的荧光发生显著猝灭，而其他金属离子对其荧光影响很小，据此建立了以PAAMN为荧光探针，荧光猝灭法测定Cu(Ⅱ)的新方法，并且成功将其应用于水样中Cu(Ⅱ)的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

F4600型荧光分光光度计(日本，日立高新技术公司);UV-2600型紫外分光光度计(日本，岛津制作所);320-S型pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司);KQ-50E型超声波清洗机；HH-2型恒温水浴锅(上海启前电子科技有限公司)。

PAAMN为本实验室自制[13]。用水溶解PAAMN配制成浓度为2.0 mg·mL-1的储备液，置于4 ℃冰箱中保存，临用时用水稀释至适当浓度。按常规方法配制浓度为1.0×10-3mol·L-1的各种金属离子溶液，临用时用水稀释至适当浓度。其他试剂为分析纯，实验用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1PAAMN的制备[13]PAAMN参考文献方法[13]制备。将0.5 g PAA，0.63 g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC·HCl)和0.79 g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)于10 mL的DMF中室温搅拌反应1 h，然后加入2.2 g AMN的DMF溶液，并于60 ℃搅拌反应4 h。停止反应，将反应液离心除去沉淀，上清液放入透析袋中，在pH=3～4的稀HCl中透析。透析一段时间后将袋内胶状固体取出，并经过多次碱溶酸沉处理，然后将得到的固体溶解，再于水中透析，并监测透析液的荧光强度。待透析液的荧光强度为零时，冻干透析袋内溶液得PAAMN。经透射电镜及动态光散射表征，证明其形态为规则球状颗粒，水合聚合物粒径为～290 nm，荧光团的摩尔取代度为4.1%。

1.2.2荧光分析测定于刻度试管中，加入100 μL PAAMN溶液，2.0 mL磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=7.4)，1.0×10-4mol·L-1的Cu(Ⅱ)溶液适量，用水定容至5.0 mL，摇匀。同时进行空白对照。将各溶液于室温下静置15 min，然后以390 nm为激发波长，分别测定空白及样品溶液在534 nm处的荧光强度F0及F，计算相对荧光强度ΔF(ΔF=F0-F)。

1.2.3紫外吸收光谱测定于刻度试管中，加入100 μL PAAMN工作溶液，2.0 mL PBS(pH=7.4)，Cu(Ⅱ)溶液适量，用水定容至5.0 mL，摇匀，室温下静置15 min，然后测定溶液的紫外吸收光谱。

2 结果与讨论

2.1 PAAMN对不同金属离子的荧光响应

PAAMN能溶于水得到黄色透明溶液，其具有好的荧光，在水中的荧光量子产率为0.14[13]。在pH为7.4的PBS中，PAAMN的激发和发射光谱如图1所示。从图中可以看出，PAAMN的最大激发和发射波长分别为390 nm和534 nm。为了考察PAAMN对不同金属离子的荧光响应，我们测试了pH=7.4条件下，常见金属离子Cu(Ⅱ)、Zn2+、Hg(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)、Li+、Ba2+、Pb2+、Ag+、Ca2+、Al3+、Co2+、Ni2+、Mn(Ⅱ)、Mg2+对PAAMN的荧光光谱影响。结果发现，上述离子的存在对PAAMN的荧光激发和发射波长没有影响。在荧光强度方面(图2)，除了Cu(Ⅱ)能使PAAMN的荧光发生显著的猝灭，其他金属离子对PAAMN的荧光强度没有显著影响(荧光强度变化<±5%)。因此，PAAMN对Cu(Ⅱ)具有选择性，可采用荧光猝灭法测定Cu(Ⅱ)。

图1 PAAMN的荧光激发与发射光谱Fig.1 Fluorescence excitation and emission spectra of PAAMN 1-excitation spectrum;2-emission spectrum;λex=390 nm,λem=534 nm,slit width:10/20 nm;pH=7.4.

图2 不同金属离子对PAAMN荧光强度的影响Fig.2 The effect of different metal ions on the fluorescence intensity of PAAMNλex=390 nm,λem=534 nm.

2.2 Cu(Ⅱ)对PAAMN的荧光猝灭机理

图3 Cu(Ⅱ)加入前后PAAMN的紫外-可见(UV-Vis)吸收光谱Fig.3 UV-Vis absorption spectra of PAAMN with and without Cu(Ⅱ) PAAMN: 0.2 mg·mL-1; Cu(Ⅱ): 5.0×10-6 mol·L-1;pH=7.4.

荧光猝灭机理分为动态猝灭和静态猝灭，前者指荧光物质与猝灭剂相碰撞而导致荧光强度的降低，一般不会引起物质结构的变化；后者是由于荧光物质与猝灭剂形成非荧光的复合物。紫外吸收光谱是表征荧光猝灭机理的常用手段，通常伴随着紫外吸收光谱变化的荧光猝灭为静态猝灭，否则为动态猝灭[14]。从结构上看，PAAMN含有丰富的N原子和O原子，易于和Cu(Ⅱ)形成络合物导致荧光猝灭。为验证Cu(Ⅱ)对PAAMN的静态猝灭作用，测定了Cu(Ⅱ)加入前后PAAMN的紫外-可见吸收光谱，结果如图3所示。从图中可以看出，Cu(Ⅱ)加入使PAMMN吸光强度减小，出现明显的减色效应，说明Cu(Ⅱ)与PAAMN之间确实形成了新的Cu(Ⅱ)/PAAMN体系，Cu(Ⅱ)对PAAMN的荧光猝灭属于静态猝灭。

2.3 测定条件优化

2.3.1缓冲溶液pH值的影响以PBS为介质，考察pH在5.0～9.5范围内Cu(Ⅱ)对PAAMN荧光强度的影响。从图4所示结果可以看出，随着pH的升高，ΔF逐渐增大，在pH为7.0时达到最大值并在pH=7.0～8.0范围内趋于稳定，随后逐渐减小。因此，最终选择pH=7.4为测定Cu(Ⅱ)的最优pH条件。

2.3.2反应温度和时间的影响考察了不同温度(37 ℃、60 ℃)下，ΔF随反应时间的变化，结果如图5所示。从图中可见，各测定温度下，ΔF均随着反应时间增加而逐渐加大，升高温度仅使PAAMN与Cu(Ⅱ)的前期反应速率略微加快。各温度下均需要反应15 min才能达到最大值，且最大值间没有明显不同。为了操作方便，本实验选择PAAMN与Cu(Ⅱ)在室温下反应15 min后测定。

图4 pH值对ΔF的影响Fig.4 The influence of pH on ΔFλex=390 nm,λem=534 nm.

图5 反应时间和温度对ΔF的影响Fig.5 Effect of reaction time and temperature on ΔF-room temperature,-37 ℃,-60 ℃;λex=390 nm,λem=534 nm.

2.3.3试剂加入顺序及稳定性在选定的实验条件下测定了缓冲溶液、Cu(Ⅱ)及PAAMN的加入顺序对ΔF的影响。实验证明，改变试剂加入顺序对ΔF没有影响。此外，该测定体系具有良好的稳定性，反应完全后的ΔF值在室温下至少可以稳定24 h。

2.4 干扰实验

当Cu(Ⅱ)浓度为5.0×10-6mol·L-1时，考察了常见金属离子对测定的影响。实验证明，在允许误差≤±5%范围时，以下量的共存离子不干扰：1 000倍的Zn2+、Fe(Ⅲ)、Hg(Ⅱ)、Ba2+、Ni2+、Ca2+、Co2+、Pb2+及Li+，100倍的Al3+、Mg2+及Mn(Ⅱ)，50倍的Ag+。

2.5 线性范围、检测限和精密度

在选择的最佳实验条件下，测定了ΔF随着Cu(Ⅱ)浓度的变化情况，并绘制工作曲线。结果表明，ΔF值随着Cu(Ⅱ)浓度增大而增加，并且与0.1～5.0×10-6mol·L-1的Cu(Ⅱ)浓度呈良好线性关系，线性回归方程为:ΔF=156.39c+31.475，相关系数为0.9952，测定Cu(Ⅱ)的检测限为1.3×10-8mol·L-1。说明PAAMN测定Cu(Ⅱ)具有较高的灵敏度，可以用于环境水样，甚至是饮用水样品中Cu(Ⅱ) 的测定[15 - 16]。

对浓度为5.0×10-7mol·L-1、1.0×10-6mol·L-1和5.0×10-6mol·L-1的Cu(Ⅱ)分别测定6次，计算相对标准偏差(RSD)分别为1.2%、2.4%和2.3%。说明该测定方法具有较好的精密度。

2.6 样品测定

按1.2.2中所示方法，采用标准加入法测定了自来水、东湖水以及市售饮用纯净水中的Cu(Ⅱ)浓度。东湖水样测定前进行了过滤，其它样品未经任何处理。自来水和东湖水样品的加标量均为0.2 mL，纯净水样品的加入量为1.0 mL。样品加标回收测定结果见表1。

表1 水样分析结果

3 结论

根据在水相及生理pH条件下，Cu(Ⅱ)能使水溶性聚合物纳米粒PAAMN的荧光发生显著降低，并且在一定范围内荧光猝灭程度随着Cu(Ⅱ)浓度增大而增加这一现象，建立了一种以PAAMN为荧光探针，荧光猝灭法检测水样中Cu(Ⅱ)浓度的新方法。该方法测定Cu(Ⅱ)的线性范围为0.1～5.0×10-6mol·L-1，检测限为1.3×10-8mol·L-1。方法具有探针水溶性好，测定波长的Stokes位移大，对Cu(Ⅱ)的选择性和灵敏度高，系统稳定性好等特点，可应用于水样中Cu(Ⅱ)的检测。