普通橄榄和清橄榄果实游离氨基酸差异成分与谷氨酰胺代谢

彭真汾，叶清华，王 威，谢 倩，陈清西*

（福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002）

橄榄（Canarium album (Lour.) Raeusch），为橄榄科（Burseraceae）橄榄属（Canarium）植物[1]，主要分布于中国福建和广东两省，是我国南方特有的热带、亚热带果树[2-3]。橄榄果实营养价值高，富含VC、钙等营养物质[2-3]，兼具较高的药用价值[4-8]，是一种药食两用的水果[9]。橄榄有普通橄榄和清橄榄之分，普通橄榄口味酸涩，多用于加工，清橄榄口味清淡，回甘良好，品质优于普通橄榄，更适宜鲜食。为更加了解造成普通橄榄和清橄榄鲜食品质差异的原因，本实验室前期在多酚代谢、糖代谢和氨基酸组分等方面展开研究[2-3,10]；其中林玉芳[2]利用橄榄果实氨基酸含量对橄榄风味形成进行解释；池毓斌[11]通过气相色谱-飞行时间质谱法测定橄榄果实氨基酸含量变化趋势发现普通橄榄和清橄榄的甜味氨基酸存在差异，为揭示氨基酸在2 类橄榄鲜食品质差异的研究提高理论依据。作为橄榄果实重要营养物质及风味组成成分的氨基酸，根据其状态，可分为结合态的水解氨基酸和游离态的游离氨基酸[12-13]。游离氨基酸可分为呈味氨基酸和药用氨基酸，能增加食物的风味和药用价值[14-15]，其比例和种类是作为评价植物品质优劣的主要指标之一[16]。然而，目前在橄榄氨基酸上的研究多集中于水解氨基酸[2,17-19]，主要用于评价橄榄果实的营养价值，对评价风味品质的游离氨基酸研究仍鲜见报道[12-13]，对造成普通橄榄和清橄榄风味差异的具体氨基酸及其代谢通路的研究几乎没有，并且对于甜味氨基酸与果实中糖之间相关性的研究甚少。

液相色谱与质谱联用技术属于直接色谱法测定氨基酸，无需衍生，能够简单、快速测定氨基酸，即使在液相色谱难分离的情况下，质谱能对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混合物中的目标化合物，显著提高信噪比[20]。目前已在血浆[21]、烟草[22]、中药[23-24]等样品氨基酸分析研究中得到应用。因此，本实验在采用高效液相色谱-串联质谱法定性定量测定普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’果实游离氨基酸的基础上，通过多元统计分析方法找出2 类橄榄显著差异的氨基酸，对其代谢通路进行研究，并展开甜味氨基酸与果实中糖相关性的研究，为今后普通橄榄和清橄榄鲜食品质的研究和调控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2015年‘长营’、‘清榄1号’橄榄采于福建省闽清县久源橄榄专业合作社，仅采摘花后190 d，2016年于花后30 d开始，每隔20 d采摘1 次，共9 次；样品采摘每个品种选取3 株橄榄树，按照东南西北4 个方向挑选无畸形、无病虫害且大小相近的橄榄果实于4 ℃保温箱带回实验室。

乙腈、甲酸、甲醇（均为色谱级） 德国Merck公司；乙酸铵、20 种氨基酸标准品（甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、丝氨酸（Ser）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、苏氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、谷氨酰胺（Gln）、赖氨酸（Lys）、谷氨酸（Glu）、甲硫氨酸（Met）、组氨酸（His）、苯丙氨酸（Phe）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp））（均为色谱级） 美国Sigma公司；蒽酮、乙酸乙酯、浓硫酸、蔗糖、葡萄糖、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、结晶酚、亚硫酸钠、盐酸、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Xevo TQ-S高效液相色谱-串联质谱联用仪 美国Waters公司；LGJ-25C型冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司；FW177型中草药粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Allegra 64R型台式高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司；DK-S22型电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；RV10型旋转蒸发仪 德国IKA公司；UV WinLab V6紫外-可见分光光度计 铂金埃尔默仪器（上海）有限公司；Infinite M200 PRO多功能酶标仪 Tecan（奥地利）公司；0.22 μm型尼龙过滤器 天津津腾公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的制备

先将每个氨基酸标准品用不同体积分数甲醇溶液配制成不同质量浓度储备液。吸取一定体积储备液，用70%甲醇溶液定容至10 mL，配为混标液。再吸取混标液100、200、500 μL和800 μL，用70%甲醇溶液分别定容至1 000 μL，得到4 个质量浓度标准溶液，分别稀释10、100 倍和1 000 倍，共获得17 个不同质量浓度标准溶液。混标液中各氨基酸质量浓度见表1，剩余各氨基酸的16 个质量浓度标准溶液为稀释所得。

表1 混标液中20 种氨基酸标准溶液质量浓度Table 1 Concentrations of 20 amino acids in mixed standard solution

1.3.2 橄榄果实预处理

将用4 ℃保温箱带回实验室的新鲜橄榄，立即洗净、晾干，取果肉，一部分冻干并粉碎至过40 目筛，另一部分用液氮处理后一同保存于－40 ℃冰箱中备用。

1.3.3 橄榄果实游离氨基酸样品的提取

称取橄榄粉末0.5 g（精确至0.000 1 g）于50 mL离心管中，按料液比1∶41（g/mL）加入60%乙醇溶液，在超声功率270 W、超声温度50 ℃条件下提取20 min后，置于室温放至常温，10 000 r/min离心10 min，最后上清液过0.22 μm尼龙过滤器作为橄榄果实游离氨基酸样品，氨基酸含量测定结果以干质量计。

1.3.4 色谱条件

色谱柱：Merck ZIC-pHILIC（100 mm×2.1 mm，5 μm）；柱温40 ℃；流速0.4 mL/min；进样室温度10 ℃；进样量2 μL；流动相A为水-5 mmol/L乙酸铵溶液；流动相B为乙腈-0.1%甲酸溶液；梯度洗脱程序见表2。

表2 流动相梯度洗脱程序Table 2 Mobile phase gradients

1.3.5 质谱条件

离子源：电喷雾正离子模式；监测方式：多反应监测；离子源温度150 ℃；毛细管电压1.00 kV；锥孔电压30 V；锥孔气（N2）流量150 L/h；脱溶剂气（N2）流量800 L/h；脱溶剂温度400 ℃；碰撞气（Ar）流速0.13 mL/min；定量方式为外标法。其他质谱条件如表3所示。

表3 20 种氨基酸的质谱条件Table 3 Mass spectrometric conditions for 20 amino acids

1.3.6 Gln代谢相关酶活性测定

酶液提取均为称取0.1 g橄榄果实，加入1 mL提取液（各个酶提取液不同），进行冰浴研磨成匀浆，装于1.5 mL离心管中，4 ℃、8 000×g离心10 min，取上清液，置于冰上待测。所有酶提取过程均在冰浴条件下进行，且重复3 次。

1.3.6.1 Gln合成酶（glutamine synthetase，GS）测定

采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行GS活性的测定，结果以鲜质量计。

1.3.6.2 Glu合成酶（glutamate synthase，GOGAT）测定

采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行GOGAT活性的测定，结果以鲜质量计。

1.3.6.3 Asn合成酶（asparagine synthetase，AS）测定

采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行AS活性的测定，结果以鲜质量计。

1.3.7 蔗糖、可溶性糖和还原糖含量测定

1.3.7.1 蔗糖含量测定

采用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行蔗糖含量的测定，结果以干质量计。

1.3.7.2 可溶性糖含量测定

参考王学奎[25]的方法，采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量，结果以干质量计。

1.3.7.3 还原糖含量测定

参考王学奎[25]的方法，采用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖含量，结果以干质量计。

1.4 数据处理

数据整理和图表制作采用Excel 2013软件，显著性分析、相关性分析采用SPSS 17.0软件，仪器控制、数据采集软件为Masslynx V4.1 SCN905；数据处理软件（即积分和定量）：Masslynx中的Targetlynx；多元统计分析采用SIMCA-P＋ 11.0软件。

2 结果与分析

2.1 主成分分析（principal component analysis，PCA）结果

图1 ‘长营’和‘清榄1号’花后190 d果实游离氨基酸PCA得分图Fig. 1 PCA scores of free amino acids in ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

通过PCA方法，可以初步直观分析样品的聚集情况，发现样品间成分是否存在差异[26-27]。为寻找影响橄榄果实鲜食口感差异的氨基酸，本研究将2015年和2016年普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’花后190 d（成熟果）所测定的20 种氨基酸分别进行PCA，结果如图1所示。图1A中，2 个品种的橄榄分布在不同区域，具有明显的区别，分类结果较为理想，表明2015年花后190 d 2 种橄榄果实游离氨基酸成分存在明显差异；另外同一品种样本分布较集中，表明组内均一性良好，其中‘清榄1号’橄榄的组内均一性优于‘长营’。同理，图1B中，2 个品种橄榄也得到了明显的区分，表明2016年花后190 d 2 种橄榄果实游离氨基酸成分存在明显的差异；而与2015年相反，其‘长营’橄榄组内均一性优于‘清榄1号’。

2.2 偏最小二乘投影判别分析（partial least squares projection to latent structure-discriminant analysis，PLS-DA）结果

表4 ‘长营’和‘清榄1号’花后190 d果实游离氨基酸VIP值与P值Table 4 Variable importance plot and P values of free amino acids in‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

PLS-DA与PCA相比，为一种有监督的模式识别方法，能更大程度地将样本进行归类区分，更有利于确定样本之间的差异成分[28]。通常情况下在PLS-DA时，需通过变量权重（variable importance plot，VIP）值来描述变量的贡献程度，一般认为VIP值大于1的变量为潜在的差异成分[29]。对2015年2 个品种橄榄果实游离氨基酸进行PLS-DA，得到R2X＝0.945，R2Y＝0.995，Q2＝0.994，其R2X、R2Y值接近1，表明模型稳定可靠；Q2大于0.5，具有良好的预测性[29]。由图2A1可知，2 个品种橄榄得到更好的分离，由图2A2可知，远离中心点的氨基酸为潜在的差异氨基酸，为更准确地获得差异氨基酸，将VIP值与显著性分析t检验结合，只有VIP值大于1且P值小于0.05是差异氨基酸，由表4可知，差异氨基酸为Ala、Ser、Thr、Gln、Glu和Met；同理，对2016年2 类橄榄果实游离氨基酸进行PLS-DA，如图2B所示，得到＝0.882，＝0.997，Q2＝0.991，表明模型稳定可靠，其VIP值与P值结果见表4，可知差异氨基酸为Ser、Leu、Asn、Asp、Gln、Glu和Tyr。综合结果，认为普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’的差异氨基酸为Ser、Gln和Glu。

图2 2015年（A）和2016年（B）‘长营’和‘清榄1号’花后190 d果实游离氨基酸PLS-DA得分图和载荷图Fig. 2 PLS-DA scores plot and loading plot of free amino acids in ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after fl owering in the year 2015 and 2016

2.3 差异氨基酸含量比较

图3 ‘长营’和‘清榄1号’花后190 d差异氨基酸含量Fig. 3 Differential amino acid contents of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’ at 190 days after flowering

如图3所示，各差异氨基酸在2 个品种间都达到显著差异（P＜0.05），其中各差异氨基酸含量均以‘清榄1号’的居高。3 个差异氨基酸2015年含量最高为‘清榄1号’Glu，2016年含量最高为‘清榄1号’Gln；将其含量进行比较，可知2015年‘清榄1号’与‘长营’Ser、Gln和Glu的含量比例分别为3.41、1.16、1.39；2016年‘清榄1号’与‘长营’Ser、Gln和Glu的含量比例分别为2.66、2.12、1.34，其中差异顺序为Ser＞Gln＞Glu。综合含量值与差异倍数考虑，首先选择Gln开展代谢通路研究。

2.4 Gln与其代谢相关酶活性变化关系

2.4.1 Gln代谢相关酶活性变化

图4 Gln代谢通路简图Fig. 4 Schematic diagram of glutamine metabolic pathway

图5 ‘长营’和‘清榄1号’成熟过程中GS、GOGAT、AS活性变化Fig.5 Changes in GS, GOGAT and AS activity during the ripening of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’

GS、GOGAT和AS为Gln代谢通路上的酶，其代谢通路如图4所示。由图5可知，通过将2016年‘长营’和‘清榄1号’成熟过程中GS、GOGAT和AS活性变化进行比较，GS活性变化在‘长营’和‘清榄1号’之间差异最大，‘长营’GS活性变化为先升后降并趋于稳定，而‘清榄1号’GS活性变化为缓慢上升后缓慢下降，总体差异不大，呈平缓趋势；对于GOGAT和AS活性变化趋势在‘长营’和‘清榄1号’之间相似，两者GOGAT活性变化除花后50 d差异外，其余基本相同，‘长营’GOGAT活性变化呈降-升-降-升-降趋势，‘清榄1号’GOGAT活性变化呈升-降-升-降趋势；两者AS活性变化除花后170 d差异外，其余趋势相似，‘长营’AS活性变化呈缓慢下降趋势，最终趋于稳定，‘清榄1号’AS活性变化除花后170 d突然升高外，其余也呈缓慢下降趋势。

2.4.2 Gln与其代谢相关酶活性相关性分析

表5 Gln与其代谢相关酶相关性分析Table 5 Correlation coefficient between glutamine and metabolic enzymes

测定‘长营’和‘清榄1号’成熟过程Gln代谢相关酶活性，分析其酶活性变化趋势，在此基础上，为进一步获得对Gln代谢高度相关的酶，通过将对应品种的成熟过程中Gln含量与其相关酶活性进行相关性分析，结果如表5所示。‘长营’Gln与AS活性呈显著（P＜0.05）负相关（r＝－0.792），与GOGAT呈正相关（r＝0.392），与GS呈负相关（r＝－0.203）；‘清榄1号’Gln与GOGAT呈负相关（r＝－0.291），与AS（r＝－0.604）和GS （r＝－0.404）呈负相关，均不存在显著性差异（P＞0.05）。

2.5 Gln与蔗糖、可溶性糖和还原糖含量变化关系

2.5.1 蔗糖、可溶性糖和还原糖含量变化

图6 2016年‘长营’和‘清榄1号’成熟过程中蔗糖、可溶性糖、还原糖含量变化Fig. 6 Changes in sucrose, soluble sugar and reducing sugar contents during the ripening of ‘Changying’ and ‘Qinglan 1 hao’

如图6所示，‘长营’和‘清榄1号’蔗糖含量在成熟过程中基本呈上升趋势，‘长营’蔗糖含量为缓慢上升，花后130～170 d为其快速积累期，‘清榄1号’蔗糖含量上升幅度更大，其蔗糖含量在花后110 d后大量积累并高于‘长营’；‘长营’可溶性糖含量前期低，在花后50～90 d大量积累后缓慢下降，在花后150～170 d有一个短暂的上升期，总体含量低于‘清榄1号’，‘清榄1号’可溶性糖含量先升后降再升高，其含量在花后90～170 d大量积累，总体为上升的趋势；‘长营’和‘清榄1号’还原糖含量趋势相近，为降-升-降并趋于稳定。

2.5.2 Gln与蔗糖、可溶性糖和还原糖含量相关性分析

表6 Gln与蔗糖、可溶性糖、还原糖含量相关性分析Table 6 Correlation coefficients of Gln with sucrose, soluble sugar and reducing sugar

如表6所示，‘长营’Gln与可溶性糖呈显著负相关（r＝－0.711），与蔗糖（r＝－0.092）相关性不明显，与还原糖呈负相关（r＝－0.425），不显著（P＞0.05）；‘长营’蔗糖与可溶性糖呈极显著正相关（r＝0.902），与还原糖呈显著负相关（r＝－0.692）；而可溶性糖与还原糖呈负相关（r＝－0.414），不显著（P＞0.05）。‘清榄1号’Gln与蔗糖呈极显著正相关（r＝0.953），与可溶性糖呈显著正相关（r＝0.791），与还原糖呈显著负相关（r＝－0.780）；蔗糖与可溶性糖呈正相关（r＝0.557），与还原糖（r＝0.292）相关性不明显，均无显著性差异（P＞0.05）；可溶性糖与还原糖呈显著正相关（r＝0.747）。

3 讨论与结论

通过高效液相色谱-串联质谱方法测定2015年与2016年花后190 d普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’的游离氨基酸组分，并结合多元统计分析方法发现两者在PCA得分图中得到明显区分，表示其游离氨基酸组分存在差异，在此基础上，进行PLS-DA，分别获得2015年与2016年潜在的差异氨基酸，最后通过显著性分析，确定差异氨基酸为Ser、Gln和Glu。游离氨基酸具有呈味性，不同的氨基酸其风味不同，其中Ser和Gln为甜味氨基酸，Glu为鲜味氨基酸[12-13,30-31]，表明清橄榄‘清榄1号’其呈甜味的Ser、Gln和鲜味的Glu对其风味贡献大，与普通橄榄‘长营’存在差异，造成两者鲜食口感的差异，此结果与两者鲜食品质的评价一致[11]，为今后研究游离氨基酸对普通橄榄和清橄榄鲜食品质差异提供一定的依据。

Gln和Glu为植物合成有机氮化合物的第1步，其中，GS将铵盐与Glu结合生成Gln，GOGAT又可以将Gln提供的酰胺基与2-酮戊二酸反应生成Glu，此过程被称为GS/GOGAT循环，对植物体内的氮代谢具有重要的作用[32]。此外，Gln还能提供氨基与Asp在AS的催化条件下合成Asn[32]。通过将普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’成熟过程中Gln代谢相关酶活性测定后发现，GS活性变化在‘长营’和‘清榄1号’之间差异最大，GOGAT和AS活性变化趋势在‘长营’和‘清榄1号’之间相似，其酶活性的变化差异对Gln的代谢造成影响，使‘长营’和‘清榄1号’Gln含量变化趋势不同，为更直观观察代谢酶对Gln的影响，通过相关性分析，发现仅‘长营’Gln与AS活性呈显著（P＜0.05）负相关（r＝－0.792），其余酶虽与Gln具有一定的相关性，但均不显著（P＞0.05）。因此，认为AS为与Gln高度相关的酶，为今后实验的研究重点。

糖类为橄榄果实中重要的品质成分，其对橄榄的风味具有重要贡献。果实中的可溶性糖主要分为蔗糖、果糖和葡萄糖，其中果糖和葡萄糖为还原糖。三者中以果糖的甜度最高，蔗糖次之，葡萄糖最低[10,33]。Gln为甜味氨基酸，同样对果实的甜味风味具有贡献。通过查询KEGG上Gln的代谢通路，发现其最终能生成略带甜味的氨基葡萄糖，其广泛存在于细菌、丝状真菌、酵母和动植物体内，但目前多在大肠杆菌[34]和动物[35]中进行研究鲜见植物中的相关报道。为研究Gln对果实中糖代谢的影响，本实验测定普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’成熟过程中蔗糖、还原糖和可溶性糖含量，发现蔗糖含量在成熟过程中基本呈上升趋势，均存在一个快速积累期，对比成熟时可溶性糖含量，发现‘清榄1号’高于‘长营’，还原糖含量相当，造成可溶性糖含量的差异主要由蔗糖引起，此结果与李泽坤[10]研究结果一致。进而将Gln与蔗糖、还原糖和可溶性糖进行相关性分析，发现‘长营’Gln与可溶性糖呈显著负相关（r＝－0.711），与蔗糖（r＝－0.092）相关性不明显，与还原糖呈负相关（r＝－0.425），无显著性（P＞0.05）；‘清榄1号’Gln与蔗糖呈极显著正相关（r＝0.953），与可溶性糖呈显著正相关（r＝0.791），与还原糖呈显著负相关（r＝－0.780）。表明在‘长营’果实中Gln含量越高，其可溶性糖含量越低，相反，在‘清榄1号’果实中Gln含量越高，可溶性糖、蔗糖含量越高，还原糖含量越低，此结果与万继锋等[17]研究认为橄榄果实中糖和氨基酸含量存在相关性一致。综上，Gln含量与普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’中糖类具有高度相关性，且存在差异，其可通过调节Gln代谢实现橄榄果实糖含量的调控，进而调控果实风味。

本研究通过高效液相色谱-串联质谱结合多元统计分析方法已获得普通橄榄‘长营’和清橄榄‘清榄1号’的差异氨基酸Gln、Ser和Glu，并发现与Gln代谢高度相关的酶AS，以及Gln对2 种橄榄果实糖含量的差异影响，后续可首先通过对Ser和Glu代谢相关酶活性进行测定，研究其含量与糖含量相关性，再从分子生物学角度对Ser、Glu和Gln相关酶基因进行克隆和定量测定，从分子生物学角度查找造成普通橄榄和清橄榄口感差异的关键基因，将分子生物学与代谢组学方法相结合，以便进一步从氨基酸角度实现对普通橄榄与清橄榄鲜食品质的调控提供更多依据。