三疣梭子蟹NF-κB家族基因Relish和Dorsal的克隆及表达特征

赵姣姣 陶 震 周素明 金 珊 王国良 周岐存

(宁波大学海洋学院生物技术教育部重点实验室, 宁波 315211)

NF-κB广泛存在于多细胞动物, 是一类能与免疫球蛋白特异性结合并能促进免疫相关基因表达的核转录因子, 该基因在进化的过程中非常保守[1, 2]。大量研究发现NF-κB能与细胞因子、黏附因子基因启动子等的特定位点发生特异性结合, 进而参与这类基因转录的调控, 在机体的免疫应答、炎症反应、细胞凋亡和生长发育方面发挥着重要的作用[2]。甲壳动物等低等无脊椎动物具有较为完善的先天非特异性免疫系统, 包括屏障作用、滤过作用、细胞免疫及体液免疫等, 在受到外界病原刺激后能有效地识别和清除入侵的病原体[3]。目前在节肢动物中已经鉴定的NF-κB家族有3 个成员, 包括Relish、Dorsal 和Dif等[4]。在果蝇中, Relish参与免疫缺陷(Immune deficiency, IMD)信号通路并介导抗革兰氏阴性菌的免疫过程, Dorsal则主要参与Toll信号通路介导抗革兰氏阳性菌以及真菌的免疫相关过程[5]。

三疣梭子蟹, 学名Portunus trituberculatus, 属甲壳纲(Crustacea), 十足目(Decapoda), 梭子蟹科(Portunidae), 梭子蟹属(Portunus), 是我国主要的海水蟹类养殖品种, 但是在环境污染、自身污染以及养殖技术等等诸多因素的影响下, 三疣梭子蟹病害的发生率逐年上升, 并制约了其养殖业的进一步发展, 溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌[6]。在无脊椎动物中Rel/NF-κB家族基因研究已有很多报道, 例如中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)[7]、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[8]、斑节对虾(Penaeus monodon)[9]等都有对Relish、Dorsal的研究报道, 而对三疣梭子蟹Relish、Dorsal基因的研究尚未见报道。本研究以三疣梭子蟹为对象, 通过RACE技术成功克隆了Pt-Rel以及Pt-DorcDNA全长, 并以三疣梭子蟹离体原代培养血细胞作为模型分析其在不同病原刺激下的表达情况, 为三疣梭子蟹抗感染免疫通路的研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

三疣梭子蟹购自宁波市路林市场, 选择体色正常, 无异味, 健康无发病、大小规格相当的个体。

1.2 三疣梭子蟹总RNA提取及cDNA第一链合成

抽取三疣梭子蟹血细胞利用RNA提取试剂盒Trizol (Invitrogen, Life Technologies)获得总RNA,使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthseis Kit反转录试剂盒(TaKaRa, 宝生物)合成第一链cDNA, 合成的cDNA产物于保存于-20℃备用。

1.3 Pt-Rel、Pt-Dor基因克隆及测序

根据NCBI数据库中已知的其他甲壳动物Relish和Dorsal的保守序列设计出3′、5′ RACE特异引物(表 1), 以上述合成的第一链cDNA为模板使用3′以及5′ Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRTase试剂盒(TaKaRa, 宝生物)PCR扩增Pt-Rel及Pt-Dor全序列, PCR结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 并用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化。

将纯化的产物连接到pMD-18T (TaKaRa, 宝生物)载体上, 并转化到感受态细胞DH5α (TaKaRa, 宝生物)中进行蓝白斑筛选, 挑取阳性克隆PCR检测后送上海华大基因科技有限公司测序。

1.4 生物信息学分析

将拼接后的Pt-Rel和Pt-Dor基因序列进行生物信息学分析。ORF Finder确定开放阅读框(Open reading frame, ORF), ProtParam tool 预测氨基酸物理参数, Blast分析Pt-Rel及Pt-Dor氨基酸与cDNA序列并检测其与其他甲壳动物相似性, 使用MEGA 5.1 NJ (Neighbor-joining)法构建系统进化树, Smart在线软件预测蛋白结构功能域并分析。

1.5 Pt-Rel、Pt-Dor基因在6种组织中的表达

根据获得的Pt-Rel和Pt-Dor基因cDNA序列和三疣梭子蟹18S序列设计引物(表 1), 取三疣梭子蟹心脏、血淋巴、鳃丝、肠道、肌肉及肝胰腺组织提取其RNA并反转录为cDNA作为模板, 以三疣梭子蟹18S rRNA作为内参, 实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测Pt-Rel和Pt-Dor基因在各组织中的表达量, 实验数据采用2-ΔΔCt法分析, 定量引物特异性及扩增效率均经过电泳及溶解曲线检验, 通过标准曲线显示其扩增效率符合相对定量PCR要求。

1.6 血淋巴细胞的离体培养及感染实验

抗凝剂润洗无菌注射器, 从暂养的三疣梭子蟹步足关节处抽取血淋巴液, 与抗凝剂1∶1混匀, 于1.5 mL离心管中, 室温1000×g离心2min, 去上清。细胞用L15培养基(Hyclone, Life Technologies)漂洗1次后1000×g离心2min, 去上清。将漂洗干净的血淋巴细胞用添加双抗(Solarbio, 索莱宝)及胎牛血清(Gibco,Life Technologies)的L15培养基重悬并将细胞浓度调整至106个/mL。将细胞铺在12孔板中并于26℃恒温细胞培养箱培养4h, 待其贴壁后更换不添加双抗的L15培养液继续培养8—10h后用于感染实验。上述细胞分别用9×105CFU/mL的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、2.5×105CFU l/mL的溶藻弧菌(V. alginolyticus)、7.5×104CFU/mL的假丝酵母(C. lusitaniae)感染2h、4h和6h取样, 对照为非感染细胞, 每组设3个平行。

1.7 Pt-Rel、Pt-Dor荧光定量PCR

以上述微生物感染2h、4h、6h及对照原代培养血细胞提RNA并反转录为cDNA作为模板, 以GADPH作为内参进行荧光定量PCR, 数据仍采用2-ΔΔCt法分析。

表 1 PCR引物序列Tab. 1 Primers used for PCR

1.8 数据分析

利用SPSS 11.0软件进行统计分析,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 Pt-Rel和Pt-Dor序列分析

Pt-Rel和Pt-Dor经过电子拼接分别得到3254 bp和2348 bp的cDNA序列, 其GenBank序列登录号分别为: MF624027和MF624028。Pt-RelORF长2949 bp,编码983个氨基酸, ProtParam预测其氨基酸理化性质, 推出分子式为C4757H7548N1404O1502S29, 分子量109 kD, 理论等电点pI 6.52;Pt-DorORF长1911 bp,编码637个氨基酸, 氨基酸预测推出分子式为C3023H4806N846O930S30, 分子量68 kD, 理论等电点pI 8.66。

将推测的Pt-Rel、Pt-Dor氨基酸序列与已公布的其他甲壳动物的Relish和Dorsal氨基酸序列进行Blast 检索分析, Relish分析结果显示其与凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei)相似性最低, 为68%, 与中华绒螯蟹(E. sinensis)相似性最高, 为79%, 与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)三个亚型相似性分别为72%、69%和69%, 与斑节对虾(P. monodon)相似性为71%; Dorsal分析结果显示其与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)相似性最低, 为73%, 与中华绒螯相似性最高, 为81%, 与中国明对虾相似性为77%, 与凡纳滨对虾相似性为76%, 与罗氏沼虾(M. rosenbergii)相似性为75%。用MEGA 5.1软件构建系统进化树, 结果显示Pt-Rel、Pt-Dor主要与中华绒螯蟹等甲壳动物的Relish、Dorsal聚在同一分支, 而昆虫类聚在另一分支, 亲缘关系相对较远(图 1)。

Smart分析Pt-Rel、Pt-Dor蛋白结构, 结果显示Pt-Rel和Pt-Dor蛋白均包含一个RHD及IPT结构域,此外Pt-Rel蛋白还包含四个重复的ANK锚蛋白序列和一个卷曲螺旋结构(图 2)。

2.2 Pt-Rel、Pt-Dor组织分布

实时荧光定量技术检测Pt-Rel和Pt-Dor基因在不同组织中的表达情况, 结果表明Pt-Rel(图 3a)和Pt-Dor(图 3b)在检测的6个组织中都有表达, 但均在血淋巴细胞中表达量最高, 肌肉组织中表达量最低,其余各组织中表达量没有显著差异。

2.3 Pt-Rel和Pt-Dor基因表达分析

原代培养血淋巴细胞感染不同病原微生物后Pt-Rel基因表达结果显示(图 4a),C. lusitaniae感染组在2h跟对照组相比呈现极显著上调表达, 在4h恢复到对照组水平, 并一直维持到6h, 而S. aureus和V.alginolyticus感染组在2h跟对照组相比无显著变化,在4h分别呈显著、极显著上调表达, 在6h恢复到对照组水平;Pt-Dor基因表达结果显示(图 4b),C. lusitaniae感染组跟Pt-Rel基因表达情况相似, 而S. aureus和V. alginolyticus感染组在2h跟对照组相比分别呈显著、极显著下调表达, 在4h分别呈显著、极显著上调表达,S. aureus感染组在6h恢复到对照组水平,V. alginolyticus感染组在6h仍然稍有上调表达。

图 1 三疣梭子蟹与其他物种的系统进化树Fig. 1 The phylogenetic tree of Portunus trituberculatus and other species

图 2 Pt-Rel和Pt-Dor蛋白结构域预测Fig. 2 The prediction of the domain of Pt-Rel and Pt-Dor protein

图 3 qRT-PCR检测Pt-Rel和Pt-Dor在三疣梭子蟹不同组织中的表达Fig. 3 The relative expression of Pt-Rel and Pt-Dor in different tissues

图 4 原代培养血细胞感染病原微生物后Pt-Rel和Pt-Dor基因表达情况Fig. 4 The effects of pathogens on the expression levels of Pt-Rel and Pt-Dor gene in the cultivated original hemocytes

3 讨论

3.1 Pt-Rel和Pt-Dor蛋白结构

果蝇Relish蛋白结构是在N端有高度保守的RHD结构, 其中包含DNA结合位点, 二聚化位点以及核定位信号等位点, 在C端则具有数个ANK锚蛋白重复序列, 但是完整的Relish在合成后不具备转录激活作用, 只有在切除掉 ANK结构后才能激活其转录因子[10, 11]。通过蛋白结构预测分析Pt-Rel蛋白具有RHD 结构及C端的数个ANK锚蛋白重复序列, 与经典的Rel/NF-κB 家族蛋白中的Relish蛋白结构相同。果蝇 Dorsal蛋白N端与经典的Relish蛋白N端结构相似, 均具有RHD 结构域, 但Dorsal蛋白在C端不含有重复ANK序列, 只包含一个氨基酸一级结构上并不保守的转录激活域(TD)[10, 12]。根据本研究克隆所得Pt-DorcDNA序列预测Pt-Dor蛋白结构在N端具有RHD结构域与经典的Rel/NF-κB家族蛋白中的Dorsal蛋白相似; 但其C端有所不同, 表现在Pt-Dor较经典的Dorsal蛋白结构短, 似乎不具有C端的转录激活域。类似的结构在其他甲壳动物中也有发现, 比如中国明对虾[9]的Dorsal蛋白结构也是如此, 推测这种 Dorsal的形式可能是由于可变剪切造成的。通过序列同源比对分析结果发现Pt-Rel和Pt-Dor与其他几种节肢动物的Relish、Dorsal有很高的同源性, 其中Pt-Rel和Pt-Dor蛋白均与中华绒螯蟹Relish、Dorsal相似性最高, 分别为79%和81%, 与其他甲壳动物如中国明对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾以及罗氏沼虾等也具有很高的相似性, 进化分析也显示上述两个基因均与甲壳类动物聚为一支, 而昆虫类则聚为另一支, 该结果说明甲壳类与昆虫类的Relish和Dorsal在特征结构上存在一定的差异。

3.2 Pt-Rel和Pt-Dor组织分布

组织分布结果显示,Pt-Rel和Pt-Dor基因在三疣梭子蟹不同组织包括心脏、血淋巴、鳃丝、肠、肌肉及肝胰腺等均有表达, 但表达丰度有所不同。Pt-Rel和Pt-Dor基因均在血淋巴细胞中表达量最高, 而在肌肉组织中表达最低。该结果与中国明对虾[4, 10]以及罗氏沼虾[8]组织分布结果相似。血淋巴细胞是虾蟹类动物重要的免疫细胞, 一旦激活可以通过吞噬、包囊、结节形成及抗菌肽等免疫活性因子的释放来清除进入体内的异物[3]。中国明对虾Relish和Dorsal基因[4, 10]以及罗氏沼虾Relish基因[8]在血淋巴细胞中的高表达均显示其参与了机体的免疫反应过程, 因此Pt-Rel和Pt-Dor基因在血淋巴细胞中的高表达跟其他物种的Rel/NF-κB家族蛋白功能相似并很有可能参与了三疣梭子蟹的免疫反应。

3.3 Pt-Rel和Pt-Dor功能研究

目前在节肢动物中已经发现有3条抗感染免疫相关的信号通路, 包括Toll、IMD 和JNK通路。在黑腹果蝇中, Relish主要参与IMD信号途径并介导抗革兰氏阴性细菌的免疫反应, 而Dif和Dorsal则主要参与Toll信号通路并介导抗革兰氏阳性细菌及真菌的免疫应答[12]。在甲壳动物中, 中国明对虾Relish基因表达量在Vibrio(G-)感染后1h显著上升, 而Micrococcus(G+)的感染在6h才使其显著表达, 暗示中国明对虾Relish基因在抗革兰氏阴性菌更为重要[10]。中华绒螯蟹Dorsal基因在脂多糖(LPS, 来自革兰氏阴性菌)、葡聚糖(GLU, 来自真菌)以及肽聚糖(PG, 来自革兰氏阳性菌)的分别刺激下, 分别在2h、6h和12h呈显著上调表达[7], 该结果似乎表明Dorsal基因被激活后的表达差异取决于其所感染的病原体, 即Dorsal基因在某些革兰氏阴性菌的刺激下也能表达, 不仅仅只局限于真菌和革兰氏阳性菌[7]。为初步研究并探讨Pt-Rel和Pt-Dor的功能, 我们以三疣梭子蟹原代培养血淋巴细胞为模型, 利用实时荧光定量技术分析Pt-Rel和Pt-Dor基因在不同病原微生物包括S. aureus(G+)、V. alginolyticus(G-)及C. lusitaniae(真菌)感染后的表达情况。研究结果发现,Pt-Rel和Pt-Dor基因在受到不同微生物感染时其表达模式极其相似, 特别是2个基因的表达在病原酵母菌感染早期(2h)显著上调(Pt-Rel约上调7.5倍,Pt-Dor约上调5.5倍); 另外,V. alginolyticus(G-)感染4h 也极其明显诱导了Pt-Rel和Pt-Dor的表达(Pt-Rel约上调6倍,Pt-Dor约上调2.5倍)。该结果表明,Pt-Rel和Pt-Dor有可能参与三疣梭子蟹抗病原酵母菌及弧菌的免疫应答。