白肋烟烟叶氮同化能力及其对硝酸盐积累的影响

李亚飞，常栋，冯雨晴，杨惠娟，王景，王俊，史宏志

1 河南农业大学/国家烟草栽培生理生化研究基地/烟草行业烟草栽培重点实验室，郑州文化路95号 450002；

2 河南省烟草公司平顶山市公司，河南省平顶山市建设路西段263号 467002

白肋烟是一种典型的叶色黄绿突变的烟草类型，是由Yb基因突变引起的叶绿素缺乏表型，其烟叶色素含量仅为普通绿叶烟草的1/3左右[1]。白肋烟在混合型卷烟的叶组配方中约占30%，对调控其感官质量和吸食品质均具有重大贡献[2]。白肋烟烟叶硝酸盐明显较其它烟草类型高，但其积累原因不明，对提高烟叶安全性十分不利。

在生产中，白肋烟施氮量较烤烟高3～5倍，但烟叶产量却未有显著差异[3-4]。白肋烟烟叶硝酸盐含量高，氮效率和氮素利用率低，易造成环境问题和资源浪费[5]。Lewis等[6]研究指出白肋烟Yb基因突变与烟叶硝酸盐和TSNA积累存在密切关系。硝酸盐是烟叶TSNA形成的重要前体物[7-8]。Fischer等[9]研究认为烟叶硝酸盐含量水平是TSNAs的一个重要指示物，硝酸盐还原形成亚硝酸盐过程可能是限制TSNAs积累的重要环节。因此，在现阶段，降低烟叶硝酸盐是降低TSNAs的有效方法。硝酸盐同化作用受品种、施肥、光照、土壤条件等因素影响，与硝酸还原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脱氢酶（GDH）等密切相关，其中NIA和GS1基因过表达能够明显提高氮同化作用和作物产量[10-14]。目前，关于烟叶硝酸盐的研究，多集中在对TSNA形成的影响上，而针对其在白肋烟烟叶中的积累原因研究较少。

前期研究发现，通过比较白肋烟和烤烟烟叶转录组差异，两者氮代谢差异主要集中在硝酸盐还原同化相关基因表达上[15]。在此基础上，对两类型间烟叶色素含量、氮同化关键酶活性及相关基因表达情况、碳水化合物含量、硝酸盐代谢过程产物和硝酸盐积累等差异进行分析，寻找影响硝酸盐同化利用的主要因素为今后进行品种改良和调控提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料和培养

选用品种，烤烟：红花大金元（HD）和中烟100（Z100），白肋烟：TN90和TN86。试验所用材料在国家烟草生理生化研究基地人工气候室内培养。气候室条件设置：温度为22～28 ℃，每12 h昼夜交叉光照（白天时间段设置为7：00-19：00），光照800 μmol m-2s-1，湿度85 %。

烟草种子在2 %次氯酸钠中消毒2次，每次5 min，随后将其播种在填满基质的200孔育苗盘中。待烟苗长至4～5片真叶（苗龄40 d左右）时，选取长势均匀一致的壮苗，用去离子水将根系冲洗干净后，将其移栽到小花盆中，1株/盆，用石英砂固定烟苗进行水培。

1.2 试验设计

试验设置6个处理：①4 mmol/L，HD；②4 mmol/L，Z100；③4 mmol/L，TN90；④4 mmol/L，TN86；⑤24 mmol/L，TN90；⑥24 mmol/L，TN86。在前期氮水平试验（0，4，12，20，24，28，32，36 mmol/L中，确定了白肋烟和烤烟叶片生物量相同时的施氮水平，即白肋烟施氮量24 mmol/L时，与烤烟施氮量4 mmol/L时的叶片生物量相似。本试验在此基础上，分别在相同供氮条件和相同叶片生物量积累条件下，对白肋烟和烤烟烟苗碳氮代谢差异进行研究。营养液采用霍格兰氏法配置，NO3-N：NH4-N = 3：1[15]。在营养液中通入空气泵，以保持根系具有良好的通气环境。待烟草种子萌发后，每2 d换一次营养液。

1.3 测定项目与内容

1.3.1 烟株干物质积累

试验取样和测定在移栽后10 d上午（10 ：00）进行。选择长势均匀一致的烟株，将各处理烟苗平均分成3份，分别用于新鲜样本检测、新鲜样本保存（超低温冰箱-80℃中保存）和杀青样本保存。在样本分组后，把各处理每份中烟苗的根、茎和叶分离，并用去离子水清洁干净，待用吸水纸吸干后，进行测定和样本保存。杀青样本的制作方法：将各处理样本根、茎和叶清洁干净后，置入烘箱中105 ℃杀青20 min，60 ℃烘干至恒重，称重，磨碎，过60目筛子后，保存。

1.3.2 烟叶硝酸还原酶活性（NRA）和谷氨酰胺合成酶活性（GSA）、色素和可溶性蛋白质含量测定

选取各处理烟苗最大功能叶6～8支脉之间叶肉，用剪刀将其剪成2 mm × 5 mm条状，混匀后，应用D O'Neal等[16]方法测定烟叶GS活性，色素含量采用95 %乙醇提取法测定，NR活性采用活体法测定，可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定，具体方法均参照李合生[17]植物生理生化实验指导说明书进行。

1.3.3 NH4-N、NO3-N、总氮、总糖和还原糖含量测定

烟叶NH4-N含量采用茚三酮比色法测定[18]。烟叶NO3-N含量采用浓H2SO4-水杨酸法测定[19]，烟叶总氮、总糖和还原糖含量按照国家烟草行业标准YC/T161，159-2002在流动分析仪上完成检测[15]。

整株氮素积累量计算方法：

氮素积累量=（根总氮含量×根干重）+（茎总氮含量×茎干重）+（叶总氮含量×叶干重）

1.3.4 目标基因qRT-PCR测定

根据GenBank中nitrate reductase [NADH]1 [Nicotiana tabacum（common tobacco） ]（NIA1，Gene ID: 107823732）、nitrate reductase [NADH]2[Nicotiana tabacum（common tobacco） ]基因（NIA2，Gene ID: 107785409）序列、glutamate dehydrogenase A [Nicotiana attenuata]（GDHA_1，Gene ID:109225747）序列和glutamine synthetase-like [Nicotiana tomentosiformis]（GS1，Gene ID: 104119270）序列，分别设计特异性引物，具体如表1。按反转录试剂盒说明书合成cDNA 第一链, 以cDNA 为模板, 按SYBR Premix ExTaqII（Tli RNaseH Plus）说明书进行qRTPCR。反应体系含QuantiFast® SYBR® Green PCR Master Mix （2 ×）10 μL、PCR Forward Primer（10 μM × ） 0.2 μL、PCR Reverse Primer（10 μM × ）0.2 μL、Nuclease-free H2O 0.4 μL、cDNA 模板1 μL。反应程序为，95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60℃退火及延伸30 s，40个循环，每个处理3次重复，每个反应3次重复。根据扩增曲线确定每个基因的响应Ct 值，以L25为内参矫正PCR 模板的拷贝数，采用2–ΔΔCt方法计算基因相对表达量。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 qRT-PCR primers

1.4 数据分析

采用Excel2016和Origin pro 9.0软件进行数据分析和制图；使用SPSS 17.0软件进行方差分析和相关性分析，以2种类型不同品种的平均值为两个独立样本，用独立样本T检验法对烟株干物质积累量、色素、NRA、GSA、硝酸盐、总氮等指标进行方差齐性检验和T检验，对烟叶硝酸盐含量、硝酸盐同化过程产物和干物质积累与氮代谢酶活性和碳水化合物含量间进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理烟株干物质积累比较

由图1可知，在相同供氮条件下，白肋烟烟株根、茎、叶和整株干物质积累数量明显低于烤烟品种，差异达极显著水平，而白肋烟在增加5倍供氮量后，其烟株干物质积累与烤烟相近，未达到显著差异，说明白肋烟氮效率和肥料利用率较烤烟低。

图1 不同类型间烟株干物质积累的差异Fig.1 Differences of dry matter accumulation in different types tobacco leaf

2.2 不同处理烟叶色素含量比较

由图2可知，在相同氮素供应（4 mmol/L）条件下，与烤烟相比，白肋烟烟叶叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量和色素总含量相对较低，两品种（TN90和TN86）平均值分别较烤烟（HD和Z100）低41.58 %、45.08 %、30.77 %和41.72 %，差异达极显著水平，说明白肋烟烟叶叶绿素a、叶绿素b含量和色素总含量较低是该烟草类型的固有特性，可能对烟叶碳氮代谢造成不同程度的影响。在相同叶片生物量积累条件下，白肋烟烟叶叶绿素a、叶绿素b含量和色素总含量与烤烟相似。

图2 不同类型间烟叶色素含量差异Fig.2 Differences of pigment content in different types tobacco leaf

2.3 不同处理烟叶氮素还原同化关键酶活性和基因表达情况

由图3和图4可知，在相同施氮条件或相同叶片生物量积累条件下，白肋烟各品种烟叶硝酸还原酶活性/施氮量、谷氨酰胺合成酶活性/施氮量均较烤烟低，差异达极显著水平，且白肋烟烟叶氮同化基因GDHA_1、GS1、NIA1和NIA2表达水平均较烤烟低；另外，增施氮肥，白肋烟烟叶NRA和GSA有升高趋势，但增施氮肥后烟叶NRA仍低于烤烟，与基因NIA1和NIA2表达情况较为一致，说明NR可能是限制氮素还原同化的关键因素。在相同施氮量条件下，白肋烟各品种烟叶NRA和GSA均较烤烟低，差异达极显著水平，且对应硝酸盐还原同化基因（NIA1、NIA2和GS1）表达趋势一致，说明白肋烟烟叶硝酸盐还原同化能力相对较弱，是其烟叶硝酸盐大量积累的一个重要原因；在相同叶片生物量积累条件下，白肋烟各品种烟叶NRA较烤烟低，GSA较烤烟高，差异达显著或极显著水平。

图3 不同类型烟叶NRA和GSA差异Fig.3 Differences of NRA and GSA in different types tobacco leaf

图4 烟叶氮代谢相关基因表达情况Fig.4 Expression of genes correlated with nitrogen metabolism in tobacco leaf

2.4 不同处理烟叶NH4-N和可溶性蛋白质含量比较

由图5可知，不同处理各品种烟叶NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白质含量表现不同，其中在相同施氮条件和相同叶片生物量积累条件下，白肋烟各品种烟叶NH4-N含量/施氮量和可溶性蛋白质含量均明显较烤烟低，差异达极显著水平，这与白肋烟烟叶NRA和GSA较低表现一致，即白肋烟烟叶氮素还原同化能力相对较弱，对应氮素还原同化产物形成数量较少。

图5 不同类型间烟叶NH4-N和可溶性蛋白质含量差异Fig.5 Differences of NH4-N and soluble protein content in different types tobacco leaf

2.5 不同处理烟叶总氮和氮素积累量比较

由图6可知，相同施氮条件下，白肋烟烟叶总氮含量较烤烟高，差异达显著水平，而根、茎和叶氮素积累量明显均较烤烟低，白肋烟两品种整株氮素积累量的平均值较烤烟低43.33 %，差异达极显著水平，说明白肋烟烟叶总氮含量偏高不是由其氮素积累量引起的；在相同叶片生物量积累条件下，白肋烟烟叶总氮含量和氮素积累量均较烤烟高，差异达极显著水平，说明白肋烟增施氮肥会加剧烟叶总氮含量偏高的现象。

图6 不同类型间烟叶总氮和氮素积累量差异Fig.6 Differences of total nitrogen content and nitrogen accumulation in different types tobacco leaf

2.6 不同处理烟叶NO3-N含量和NO3-N/TN比较

由图7可知，相同施氮条件下，白肋烟叶NO3-N含量平均值较烤烟高103.36 %，差异达显著水平；结合白肋烟烟叶总氮含量和氮素积累情况可知，白肋烟烟叶硝酸盐大量积累不是由于其氮素积累量所决定，可能与其氮素同化能力密切相关；在相同叶片生物量积累条件下，白肋烟两品种烟叶NO3-N含量平均值较烤烟高875.09 %，差异达极显著水平。在相同施氮条件或相同叶片生物量积累条件下，白肋烟烟叶NO3-N/TN均较烤烟高，呈现显著或极显著差异。由此说明，白肋烟整株和烟叶氮素积累量相对较低，但烟叶硝酸盐含量普遍偏高，与其硝酸盐未被还原同化利用密切相关。

图7 不同处理烟叶NO3-N和NO3-N/TN差异比较Fig.7 Differences of NO3-N content and NO3-N content / total nitrogen content in different types tobacco leaf

2.7 不同处理烟叶总糖和还原糖含量比较

由图8可知，在相同氮素条件下和相同叶片生物量积累条件下，白肋烟烟叶总糖和还原糖含量明显较烤烟低，且差异均达极显著水平。其中，在相同氮素供应条件下，白肋烟两品种烟叶总糖和还原糖含量的平均值分别较烤烟低43.89 %和42.89 %；在相同叶片生物量积累条件下，白肋烟两品种烟叶总糖和还原糖含量的平均值分别较烤烟低36.46 %和64.40 %。由此可知，白肋烟烟叶碳水化合物含量较低，可能会引起碳骨架和能源物质供应不足的现象。

图8 不同类型烟叶总糖和还原糖含量差异Fig.8 Differences of total sugar and reducing soluble sugar content in different types tobacco leaf

2.8 相关性分析

在相同施氮条件下，白肋烟和烤烟烟叶总氮和NO3-N含量与烟叶NRA、GSA、总糖和还原糖含量均呈现负相关，其中NO3-N含量与烟叶NRA、GSA、总糖和还原糖含量的相关系数均达极显著水平；烟叶NH4-N、可溶性蛋白质、叶干重和地上部分干重均与烟叶NRA、GSA、总糖和还原糖含量均呈现正相关，相关系数均达极显著水平（见表2）。由此说明，烟叶硝酸盐同化活动与氮代谢酶活性和糖类物质含量关系密切，即提高烟叶氮代谢酶活性和糖类物质供应有利于降低烟叶NO3-N含量。

表2 烟叶硝酸盐同化过程物质与氮代谢酶活性和碳水化合物间相关性分析Tab.2 Correlation coefficients between nitrate assimilation products and activities of enzymes relative with nitrogen metabolism and carbohydrates in leaves

3 讨论

白肋烟调制后烟叶硝酸盐较烤烟高几倍甚至几十倍，对提高氮效率和降低TSNA形成十分不利[20,21]。在烟叶发育过程中，对白肋烟和烤烟烟叶硝酸盐积累进行了研究，得出白肋烟烟叶硝酸盐含量明显较烤烟高，且类型间差异在苗期已存在[15,22]。在本试验中，相同施氮条件下，白肋烟叶NO3-N含量较烤烟高103.36 %；白肋烟较烤烟增施5倍氮素后，其干物质积累与烤烟相近，但其硝酸盐含量较烤烟高875.09%。在前期，对白肋烟和烤烟烟叶转录组进行分析，得出类型间差异主要集中在糖类物质合成和氮同化方面[15]；在此基础上，本文通过分析白肋烟硝酸盐同化过程产物及其影响因素，探索白肋烟硝酸盐积累的生理原因。

硝酸盐被植物吸收后，需被进一步还原和同化后才算是真正利用。NR是植物硝酸盐代谢途径上的限速酶，具有将硝酸盐还原成为亚硝酸盐的作用，其活性易随施氮量增加而升高[23]。GS能够将无机氮转化成为有机氮，是氮素同化的关键酶[24]。一般情况下，硝酸盐积累的本质原因是由硝酸盐吸收作用大于其相对同化作用造成的[25]。Lu等[26]采用转基因技术对氮同化途径多个基因进行过表达，烟株35S:S523D-NR烟叶硝酸盐和TSNA含量明显下降，但缺乏氮同化酶活性对氮同化过程和硝酸盐积累的影响研究。在相同氮素供应条件下，白肋烟烟叶NIA1、NIA2、GS1和GDHA_1等氮素还原同化相关基因的表达水平较烤烟低，且NRA和GSA均较烤烟低，尤其是白肋烟在增施5倍氮肥后，其烟叶NRA仍低于烤烟，说明白肋烟烟叶氮素还原同化作用相对较弱，且其NRA偏低可能与能源物质供应不足有关，这对促进硝酸盐同化利用有负面影响。在相同氮素供应条件下，白肋烟烟叶氮素积累量明显较烤烟低，但硝酸盐含量较烤烟高。由此说明，白肋烟烟叶输入的硝酸盐未被充分还原同化引起其在叶中大量积累。因此，白肋烟烟叶氮素还原同化作用较弱，是其烟叶硝酸盐积累的重要原因。

碳氮代谢是植物活体的基础代谢，两者密切相关。氮代谢活动为烟株碳代谢提供氨基酸、酶蛋白和光合色素，是优质烟叶形成的基础[27,28]。白肋烟属于黄绿叶色烟草，其烟叶色素含量低，烟叶总糖和还原糖等碳水化合物形成较少，对硝酸盐还原同化作用有负面影响。在相关性分析中，烟叶硝酸盐还原同化过程中NH4-N和可溶性蛋白质含量与烟叶总糖和还原糖含量均呈现正相关，相关系数达极显著水平。韩锦峰等[29]研究指出，在烟叶发育过程中，碳氮比与NRA、蛋白酶活性、可溶性蛋白质和还原糖含量关系密切。因此，白肋烟烟叶色素含量低，碳骨架供应和能源物质形成较少，这可能是其硝酸盐积累的根本原因。另外，有研究指出，硝酸盐一旦积累就易出现难以再利用的现象[30]，可能会加剧硝酸盐积累问题，这有待于进一步研究。

4 结论

在相同供氮条件下，白肋烟烟株干物质积累明显较烤烟低，差异达极显著水平；在白肋烟较烤烟增施5倍氮素后，两类型间烟叶干物质积累相近。在相同供氮条件下，白肋烟烟叶氮素积累数量较低，但总氮和硝酸盐含量较高，烟叶氮还原同化酶活性（NRA和GSA）和氮同化相关基因（NIA1、NIA2、GS1、GDHA_1）表达水平均较烤烟低，氮还原同化作用相对较弱，是引起白肋烟烟叶硝酸盐积累的直接原因；白肋烟烟叶色素含量低、总糖和还原糖形成较少，为氮代谢活动提供碳骨架和能源物质不足，可能是白肋烟硝酸盐积累的根本原因。