抗纤灵对慢性肾衰竭小鼠心脏TGF-β1/Smad通路的影响

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慢性肾衰竭(CRF)是所有的慢性肾脏疾病(CKD)发展的最终结局，从病理上讲，包括肾小球及肾血管的硬化和肾间质纤维化。近年来，慢性肾衰竭的发病率正呈现逐年升高趋势，而心血管疾病占慢性肾衰竭病人死亡原因的50%以上[1]，心血管疾病病理上的突出表现为左心室肥厚、冠状动脉粥样硬化等[2]。因此，如何积极控制并延缓肾衰竭的进展和改善心血管并发症成为国内外学者关注的焦点。虽然血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂在这方面有一定的作用，但对于肾功能进行性恶化和终末期肾衰竭病人的应用受到了限制。本研究拟观察抗纤灵对慢性肾衰竭小鼠心脏转移生长因子-β1(TGF-β1)/Smad通路的影响，探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级8周龄C57BL/6小鼠，购自北京维通利华实验动物有限公司，由上海中医药大学实验动物中心分笼饲养，自由进食、饮水。

1.1.2 药物与试剂 抗纤灵组方：桃仁12 g，丹参15 g，当归12 g，酒大黄 9 g，怀牛膝15 g。由曙光医院中药房提供，煎煮20～25 min。缬沙坦胶囊(每粒80 mg)，北京诺华制药有限公司。Trizol Reagent总RNA抽提试剂盒购自美国Invitrogen公司，实时荧光定量试剂盒及逆转录试剂盒购自日本TaKara公司，Masson染色试剂盒购自南京建成生物研究所。

1.1.3 仪器 石蜡切片机(德国LEICA公司)、冷冻高速离心机 (德国Eppendorf公司)、显微镜及成像系统(麦克奥迪实业集团有限公司)、ViiA 7型实时定量PCR仪(美国ABI公司生产)。

1.2 方法 按Platt法建立慢性肾衰竭小鼠模型：小鼠适应性饲养1周后随机将小鼠分为假手术组(8只)和手术组(27只)，以2%戊巴比妥钠 0.07～0.08 mL进行小鼠腹腔注射，小鼠麻醉后取右侧卧位充分暴露左肾区，沿左肋脊下缘 1.5 cm 处消毒做斜向切开皮肤及肌层，在腹膜后取出左肾，剥离周围组织及肾包膜，再做弧形切口主要切除肾皮质，明胶海绵止血，缝合肌层及皮肤。7 d后再进行右肾全切除。假手术组只剥离左右肾包膜，术后2周眼眶采血测血肌酐，观察模型是否成功。

造模成功后，随机将手术组小鼠分为模型组(9只)、缬沙坦组(9只)、抗纤灵组(9只)。抗纤灵组予抗纤灵方煎剂0.5 mL 灌胃，药物浓度为20 g/kg ，每日1次；缬沙坦组予缬沙坦0.5mL灌胃，药物浓度为20mg/kg，每日 1次；模型组和假手术组均予等量蒸馏水灌胃，连续灌胃22周。实验终点时，模型组及抗纤灵组各剩6只，缬沙坦组、假手术组剩7只。

1.3 取材 各组小鼠眼球摘除取血后，迅速剪开胸廓，取心脏，生理盐水洗净，吸干多余水分，剪取一部分左心室放入4%多聚甲醛中行Masson染色并计算胶原面积；剩余部分心脏放入冷存管，存放于-80 ℃冰箱备用。

1.4 心脏胶原面积的比较 Masson染色示小鼠的心肌纤维呈紫红色，胶原纤维呈蓝色。每张切片随机选取4个高倍视野，用Image Pro6图像分析软件进行分析，比较每组心脏胶原面积占整个视野的百分比。

1.5 小鼠心脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7mRNA的表达 从-80 ℃冰箱中取出小鼠心脏组织，根据Trizol说明书进行RNA的抽提，用紫外分析测定所需提取2 μg的RNA体积，加DEPC水补足体积至8 μL。在 PCR管中依次加入： 5×RT buffer 0.8 μL，Inhibitor 0.4 μL，10 mmol/L dNTP mix 0.4 μL，Transcriptase 0.4 μL，使最终体积为 10 μL。在 PCR体系中依次加入(冰上操作)： 梯度稀释标准品或RT产物1 μL， SYBR premix ex taq 10 μL，RT Primer Mix 1 μL，RNase Free dH2O 7.6 μL，RoxII 0.4 μL，总体积20 μL。用荧光定量专用的PCR封口膜覆盖 96孔 PCR板，瞬时离心后放入荧光定量 PCR仪内，设定反应条件： 95 ℃ 15 s预变性，95 ℃5 s变性，60 ℃30 s退火，40 个循环。根据溶解曲线判断 PCR反应的特异性。引物信息：TGF-β1上游CCACCTGCAAGACCATCGAC，下游CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC，产物长度91；Smad3 上游ACTAACTTCCCTGCTGGCAT，下游ACTGGCTGTAGGTCCAAGT，产物长度183；SMAD7上游CTCTGTGAACTAGAGTCTCCCC下游GCTCCAGAAGAAGTTGGGAATC，产物长度163。以GAPDH为内参。

2 结 果

2.1 对小鼠心脏胶原面积的影响 与假手术组比较，模型组的小鼠心脏胶原面积显著增大(P<0.01)，抗纤灵组和缬沙坦组与模型组比较，心脏胶原面积显著缩小(P<0.01)，且抗纤灵组与缬沙坦组组间比较无统计学意义。详见表1。

表1 各组小鼠心脏胶原面积的比较(±s)

与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.01

2.2 对小鼠心脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表达水平的影响 模型组TGF-β1、Smad3 mRNA与假手术组比较显著升高(P<0.01)，模型组Smad7 mRNA与假手术组比较显著降低(P<0.01)。治疗后与模型组比较，抗纤灵组及缬沙坦组能显著降低TGF-β1mRNA的表达(P<0.01)，降低Smad3 mRNA的表达(P<0.05)，抗纤灵组与缬沙坦组比较无统计学意义(P>0.05)。经治疗，抗纤灵组及缬沙坦组Smad7 mRNA与模型组比较有显著上升(P<0.01)，两组间比较无统计学意义(P>0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠心脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA相对表达水平比较(±s)

与假手术组比较，1)P<0.01；与模型组比较，2)P<0.05，3)P<0.01

3 讨 论

慢性肾衰竭病人心血管疾病的发生率是患肾脏疾病肾正常者的5～10倍，主要表现为心室肥大、心肌缺血、心力衰竭和心源性猝死。美国高血压联合报告中已明确将肾脏疾病列为心血管疾病的独立高危因素[3]。慢性肾衰竭引起的心血管疾病与贫血、电解质紊乱、微炎症状态、氧化应激、局部肾素-血管紧张素激活、TGF-β1/Smad通路等多种因素有关。西医的治疗主要为扩血管、对症处理、透析和移植等。

慢性肾衰竭在中医学上并无此病名，根据其主要表现可归属于“溺毒”“关格”“水肿”等范畴；而慢性肾衰竭引起的心脏病变又隶属于“心悸”“胸痹”等范畴。何立群教授认为本病的中医病机为肾气亏虚、瘀血阻络，瘀浊内停而循经上犯，心脉瘀阻致心失所养，日久发而为病。确立了活血化瘀、补肾泻浊的治疗方法，方选抗纤灵扶正泄浊，攻补兼施。抗纤灵方中丹参性微寒，归心、肝经，补血活血；牛膝性平，归肝、肾经，补肾活血；桃仁性平，归心肝、大肠经，祛瘀活血；酒大黄性寒，归脾胃、大肠、心、肝经，清热泻浊活血，当归性温，归心、肝、脾经，补血活血。动物实验发现抗纤灵能抑制慢性肾衰竭大鼠肾组织TGF-β1/Smad通路的过度表达，抑制细胞外基质增生和积聚，促进细胞外基质的降解，具有改善肾纤维化和保护肾功能的作用[4]。那么抗纤灵组方能否通过改善肾功能而减轻或预防肾功能不全引起的诸如心肌纤维化等心脏病变，有待更深入的研究。

作为国际公认的促纤维化生长因子TGF-β1，可促进心肌细胞和肾小球细胞外基质的合成与沉积，并通过Smad通路等加重心、肾纤维化的过程[5]。Smad 家族被认为参与了多种原发性和继发性心脏疾病的生理病理过程，它是 TGF-β1信号传导通路里重要的效应因子，可被TGF-β1通过细胞膜表面受体启动，然后将信号传导到细胞核内，能调节靶基因的转录从而诱导其下游因子的表达。研究表明作为TGF-β1下游因子的Smad3被激活后能通过促进心肌纤维化引起心室重构[6]。在心室长期处于压力超负荷的情况下，Smad3作用增强，而Smad7作用减弱，这些都促进了TGF-β1致心肌纤维化和心室重构的发展[7]。Smad7可抑制心肌成纤维细胞胶原蛋白的合成，作为抑制型Smad，它与TGF-β受体复合物中的TGFβRI竞争性结合，阻断Smad2、Smad3的信号传导过程，抑制心室重构。除此之外，Smad7 还能与相对应的效应元件结合，通过分解 TGF-β1诱导的 Smad-DNA 复合物等方式起到抑制信号通路的作用[8]。

本实验结果显示，模型组的小鼠心脏胶原面积较假手术组显著增大，提示心肌间质出现了明显的纤维化，由此可见，慢性肾衰竭引起心脏病变的造模是成功的。抗纤灵治疗后小鼠心脏胶原面积得到了明显改善，表明抗纤灵能改善心肌纤维化，从而影响慢性肾衰竭引起的心脏重构。缬沙坦是特异性AT1受体拮抗剂，能阻断血管紧张素Ⅱ而具有抗细胞增殖和纤维化的效应。在抗心肌纤维化方面，抗纤灵组与缬沙坦组比较，两者无统计学意义，提示抗纤灵与缬沙坦疗效相当。治疗后抗纤灵组的TGF-β1、Smad3 mRNA较模型组下调，Smad7 mRNA显著上调，与缬沙坦比较无统计学意义，表明该方能通过调节TGF-β1/Smad通路发挥抗心肌纤维化的效果。

综上所述，抗纤灵具有对抗慢性肾衰竭引起的心肌纤维化作用，其作用机制可能与下调TGF-β1和Smad3 mRNA的表达、上调Smad7 mRNA的表达有关。