蛋白酶在洗衣液中的稳定性改良

吴美娜 ，李 磊 ，夏咏梅 ，刘 湘 ，王海军

（1. 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 214122；2. 江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122）

蛋白酶是洗涤剂工业中应用最广泛的酶制剂，但在洗衣液中的稳定性远远低于其在洗衣粉中的稳定性。目前使蛋白酶在洗涤剂中保持一定稳定性的途径有：改造生产蛋白酶菌株的基因[1]、将蛋白酶固定化[2，3]以及添加稳定剂[4-6]。相对于酶的改性及酶包覆技术的复杂性和较高成本，加入稳定剂以保持酶活的方法较为简便并应用广泛，但稳定性能好的稳定剂或复配稳定剂都不容易获得。常用的稳定剂有二羧酸盐、多元醇、多元酸以及一些无机盐类，另外洗涤剂中的活性成分如一些非离子表面活性剂也对蛋白酶的稳定性具有一定的影响。目前普遍采用的稳定剂种类相对较少，硼酸盐类稳定剂如硼砂的效果较好，基本能满足室温下加酶洗衣液的酶活保持要求，但硼砂已被欧洲禁止在加酶洗涤剂中使用[7，8]。因此，广泛和深入地研究稳定剂、表面活性剂和环境因素对酶活的影响，并且给出切实有效的解决方案有着重要的实际意义。基于此，本实验筛选对蛋白酶酶活可能有稳定效果的系列化合物如与硼砂结构类似的柠檬酸盐，选用一款通用洗衣液配方，探讨pH、温度、洗涤剂中主表面活性剂、稳定剂种类及其用量等因素对酶活的影响，以期筛选出对酶活稳定性好的化合物或组合，为蛋白酶在洗衣液中的酶活保持以及加酶洗衣液的配方设计提供参考。

1 实验部分

1. 1 主要试剂与仪器

柠檬酸铵（AR）、甘油（AR）、十水合四硼酸钠（AR）、EDTA-2Na （AR）、无水氯化钙（AR）、吐温系列（AR）、司班20 （AR）、干酪素（CP）、山梨醇（BR）和福林试剂（BR），国药集团化学试剂有限公司；柠檬酸镁（w=99%），湖北如天生物工程有限公司；柠檬酸（食品级），河北百味生物科技有限公司；柠檬酸单甘酯（食品级），南京绿意生物科技有限公司；APG0810，APG1214，上海发凯化工有限公司；柠檬酸钙（食品级）、AEO7（有机物含量为99%）、AEO9（有机物含量为99%）、AES （有机物含量为70%），山东优索化工科技有限公司。洗衣液配方（各组分以干基计，w）：AES，21.5%；AEO7，2.5%；AEO9，2.5%；柠檬酸三钠，3.5%；聚醚消泡剂，0.05%；柠檬酸，0.1%；NaCl，0.5%；荧光增白剂，0.14%；开松，0.05%；柠檬香精，0.1%；余量为去离子水。实验用水为去离子水。

DKB-501A型超级恒温水槽，上海森信实验仪器有限公司；EL204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；ZHWY-103B型恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司；T6新世纪紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1. 2 实验方法

1. 2. 1 Folin法测定蛋白酶酶活

将1%的酪蛋白溶液1 mL置于试管中，于40 ℃恒温水浴中恒温15 min，加入1 mL稀释一定倍数的酶液。反应15 min后，加入2 mL三氯乙酸（0.4 mol/L）终止反应。继续放置于水浴中恒温15 min，过滤。移取滤液1 mL，加入5 mL碳酸钠溶液（0.4 mol/L）和稀释好的福林试剂1 mL，摇匀后继续置于40 ℃恒温水浴中20 min，恢复至室温后用紫外分光光度计测定波长660 nm处的吸光度。在40 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸，定义为1个蛋白酶酶活单位。酶活单位为U/mL。

式中，A，由样品测得的吸光度，与标准曲线比对可得到相应的酪氨酸质量（μg）；4，从4 mL反应液中取出1 mL溶液测定；t，反应时间，min；N，酶稀释倍数。

除误差线明确标示的以外，所有数据的相对误差均小于5%。

1. 2. 2 酶活保持率的测定

依次加入蛋白酶和稳定剂于20 mL样品瓶中，用涡流振荡器将其混匀；之后再加入液体洗涤剂，使得溶液总质量为10 g；酶的最终质量分数为0.5%。搅拌混匀，并将此溶液置于恒温装置中保存，于不同时间取样，一式两份，稀释后采用Folin法测定此时体系中蛋白酶酶活。实验时间下体系中蛋白酶酶活与初始体系中蛋白酶酶活的百分比即为酶活保持率。

2 结果与讨论

2. 1 稳定剂的筛选

硼砂曾经被作为物美价廉的蛋白酶稳定剂使用，直至欧盟禁用。本实验以硼砂作为参照，选用与硼砂结构相近的柠檬酸盐、多元醇、多元醇类非离子表面活性剂等16种稳定剂考察它们对3种蛋白酶在洗衣液体系中的稳定作用（图1）。其中，稳定剂与所加酶的质量比 分别为：m（柠檬酸镁）∶m（酶）=1∶10，m（柠檬酸钙）∶ m（酶）=1∶4 000，m（其他稳定剂）∶m（酶）=1∶1。在40 ℃下保存加酶洗涤剂24 h后，柠檬酸盐尤其是柠檬酸铵钙（用柠檬酸铵和柠檬酸钙按质量比20∶1混合而得）的稳定效果最好。柠檬酸铵钙使得Purafect 4 000 L、EFFECTENZ P150和Purafect Prime 4 000 L的24 h酶活保持率分别比硼砂提高了19.75%，66.09%和37.91%。

图 1 40 ℃下稳定剂对蛋白酶酶活性的影响Fig. 1 Effect of stabilizers on the proteases activity at 40 ℃

柠檬酸铵钙和柠檬酸钙对蛋白酶酶活保持率具有显著的促进作用，可能是由于钙离子作为酶的辅基能够与酶的活性中心结合，使蛋白酶活性中的疏水结构向蛋白酶内部转移，让酶分子结构变得更为紧密而利于蛋白酶酶活的提高[9]。多元醇系列也对蛋白酶酶活有一定稳定作用，可能是由于多元醇系列物质能结合酶蛋白周围的自由水，降低水活度，从而对酶活保持率起到正协同效应。而非离子表面活性剂吐温系列和APG系列及司班20对3种蛋白酶活的保持存在一定差异，且均劣于硼砂优于空白。APG系列作为有一定去污能力的非离子表面活性剂，也可用于洗衣液中。因此以下将APG系列与柠檬酸铵钙复合使用，考察柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214作为三元复合稳定剂体系对蛋白酶在洗衣液中的稳定作用。

2. 2 复合稳定剂对蛋白酶在洗衣液中的稳定作用

Purafect 4000L和EFFECTENZ P150这2种蛋白酶的基础性质比较接近，故选择其中一种进行进一步的研究。考察柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214作为三元复合稳定剂体系对蛋白酶Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在洗衣液中稳定的影响。

选取L9（34）正交表，以蛋白酶酶活为指标，4个因素分别为柠檬酸铵钙含量、APG0810含量、APG1214含量和蛋白酶含量，以确定三元复合稳定剂的最佳参数条件，正交试验的因素和水平见表1，不同时间点下正交试验的结果见表2和3。

表 1 正交试验的因素和水平Tab. 1 Factors and levels for the orthogonal test

表 2 Purafect 4000L酶活稳定性正交试验结果（40 ℃）*Tab. 2 Or thogonal test results of activity stability of Purafect 4000L （40 ℃）*

由表2和3可知，复合稳定剂对Purafect 4000L的96 h酶活保持率均优于硼砂和柠檬酸铵钙。复合稳定剂对Purafect Prime 4000L的96 h酶活保持率均劣于柠檬酸铵钙，但实验号为5和9的复合稳定剂的7 d酶活保持率与柠檬酸铵钙的几乎一致。考虑到APG的属性和可以减少柠檬酸铵钙的使用，复合体系应该是个较好的选择。通过对各个时间点下正交试验的极差分析可知，2种酶的96 h酶活保持率的影响因素大小顺序均为：加酶量＞ APG1214含量＞APG0810含量＞柠檬酸铵钙含量。一周酶活保持率的最优组合分别为：2%柠檬酸铵钙，1% APG0810，2% APG1214和0.5% Purafect 4000L；以及2%柠檬酸铵钙，0.5% APG0810，0.5% APG1214和0.5% Purafect Prime 4000L。此外，40 ℃下实验号为5和9的实验组存放4周后，Purafect 4000L酶活仍保持约42%。

当加酶量为0.5%（最终质量分数）时，Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214复合稳定剂体系中的最佳组合分别为（以下均为质量分数）：2%柠檬酸铵钙，1% APG0810和2% APG1214；2%柠檬酸铵钙，0.5% APG0810和0.5% APG1214。将用上述2个复合稳定剂稳定的洗衣液分别放置于不同pH值和温度下保存，以硼砂作为阳性对照，实验结果如表4所示。

结果表明，所用复合稳定剂大幅提高了Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的pH和热稳定性，尤其是在37 ℃下的pH稳定性。在pH=7，25 ℃下，Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的复合稳定剂体系的3周酶活保持率分别可达到84.3%和71.5%；而在pH=8，37 ℃下的3周酶活保持率分别为47.2%和30.4%，相应地，37 ℃下硼砂体系的3周酶活保持率分别为2.87%和13.5%。与表2中相应数据对比表明，即便在硼砂的稳定下，这2种酶在40 ℃时的洗衣液中的稳定性也会急剧下降。此外，实验条件下，37 ℃下Purafect 4000L在所测试的洗衣液中的稳定性在pH=7～8内对pH不敏感；37 ℃下，复合稳定剂的优势不及25 ℃下的明显。

表 3 Purafect Prime 4000L酶活稳定性正交试验结果（40 ℃）*Tab. 3 Or thogonal test results of activity stability of Purafect Prime 4000L （40 ℃）*

表 4 pH和温度对蛋白酶酶活稳定性的影响*Fig. 4 Effects of pH and temperature on protease activity*

2. 3 表面活性剂对Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的酶活影响

本实验选取的洗衣液配方的主表面活性剂是目前常用的阴、非离子表面活性剂（见实验试剂部分），即AES，AEO7和AEO9。3种表面活性剂在其cmc（25 ℃下以质量浓度表达的cmc分别为：AES，1.065 g/L；AEO7，0.048 g/L；AEO9，0.056 g/L）及更低质量浓度下对酶活的影响见图2和3。其中，图3的试验溶液为AEO和AES的混合表面活性剂溶液，且AEO的质量浓度为 4 g/L （m（AEO7）∶m（AEO9）=1∶1）。

图2和3表明，阴离子表面活性剂AES对酶活影响较大，而非离子表面活性剂AEO7和AEO9对酶活的影响相对于AES较小。对于混合表面活性剂体系，AEO和AES的混合并不能降低AES对酶活的损伤。因此将来可以考虑在液体加酶洗涤剂中增加APG和AEO的使用。

图 2 表面活性剂对蛋白酶酶活的影响Fig. 2 Effect of surfactants on protease activity

图 3 混 合表面活性剂对Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L酶活的影响Fig. 3 Ef fects of mixed surfactants on Purafect 4000L and Purafect Prime 4000L enzyme activities

3 结论

通过考察16种柠檬酸盐、多元醇及多元醇类非离子表面活性剂对EFFECTENZ P150、Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L在洗衣液中的酶活保持率的影响，发现柠檬酸盐尤其是柠檬酸铵钙的稳定效果最佳，APG0810，APG1214的与硼砂接近。进而以柠檬酸铵钙-APG0810-APG1214复合稳定剂稳定洗衣液中的Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L。较佳复合稳定剂配方为（加酶量为总体系质量的0.5%）：Purafect 4000L，2%柠檬酸铵钙-1% APG0810-2% APG1214；Purafect Prime 4000L，2%柠檬酸铵钙-0.5% APG0810-0.5% APG1214。Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的复合稳定剂体系在pH=7和25 ℃下的3周酶活保持率分别可达到84.3%和71.5%；而在pH=8和37 ℃下的3周酶活保持率分别为47.2%和30.4%；硼砂体系pH=7和37 ℃下的3周酶活保持率分别为2.87%和13.5%。

洗衣液中的阴离子表面活性剂AES会相对较大幅度地降低Purafect 4000L和Purafect Prime 4000L的酶活并有剂量效应；非离子表面活性剂AEO7和AEO9对其酶活无显著影响，但AEO和AES的混合并不能降低AES对酶活的损伤；将来可以考虑在液体加酶洗涤剂中增加APG或AEO系列表面活性剂的使用。