普通高中植物组织培养实验室的建设与课程实践

钱敏艳 王晓芳

摘要 叙述了普通高中应如何开展植物组培实验的建设和课程开发以及组织培养过程中的一些成功的经验和不足之处的反思。

关键词 植物组织培养 实验室建设 课程实践

中图分类号 G633.91

文献标志码 B

1新课标对植物组织培养技术的要求

《普通高中生物学课程标准（2017年版）》（以下简称新课标）的基本理念强调以核心素养为宗旨，教学过程重实践，在教学过程中要让学生主动参与学习过程，多动手动脑，加深对生物学概念的理解，进而提升应用知识的能力。在新的高中生物学课程结构中，选择性必修模块《生物技术与工程》以及选修模块“学业发展基础”都要求学习植物组织培养技术。选择性必修模块《生物技术與工程》的内容标准中要求学生阐明植物组织培养是在一定条件下，将离体植物器官、组织和细胞在适宜的培养条件下诱导形成愈伤组织，并重新分化，最终形成完整植株的过程。新课标认为植物组织培养室不需要昂贵的仪器设备和药品，投资少，可以在短时间内不受自然条件限制培育出大量具有优良性状的幼苗。在新课标下，建设一个适合学生使用的植物组织培养实验室将成为必然。

2植物组织培养实验室的改建与设备购置

作为一般的普通高中，建设一个与大学实验室条件相当的植物组织培养室需要30万左右的资金，实现的可能性较小。我校的自然科学实验中心虽为江苏省课程基地项目，但由于是数理化生共建的项目，所以经费也并不是太充裕。为了既能适应新课程标准对教学的要求，又能在力所能及的范围内完成实验室改造，我校对植物组织培养实验室进行了如下的建设，总体的费用约10万。

2.1实验室的改建

通过对高校和一些中学生物课程基地校植物组织培养实验室的参观学习，以及与生物技术公司的交流，选择了一间光线良好、长12m、宽8m的普通实验室进行改造。为了满足植物组织培养室的各种条件，把实验室分成了更衣室、无菌室、培养室、炼苗室、教学区等区域。

2.2实验设备的购置

植物组织培养过程中对无菌的要求很高，我校在改建中为了节省成本，没有建风淋室。为了保证实验效果，购置了紫外灭菌灯放在无菌室，用于实验前的环境消毒。除此之外，高压灭菌锅、超净工作台、接种器具杀菌器、组培接种服等都是满足无菌条件的重要保障。决定组织培养能够成功的另一重要因素是培养基，教师可以根据教材上的培养基配方自己配制，也可以直接从生物技术公司购买MS培养基。MS培养基中的各种元素比例要求严格，如果直接拿自来水来配制也会导致实验的失败，因此需要用纯水器来制备超纯水。接种后的无菌苗必须置于洁净度高、光照充足、温湿度适宜的环境。智能光照培养箱能够满足以上要求，它与光照培养架的不同在于可以提供恒定的温度，具有温度、光照度程序设定功能，能够满足实验的要求。具体设备购置情况见表1，如果实验室建设经费有限，其中的移液器、电热鼓风干燥箱可以暂不购置。

3课程开发

3.1课程说明

植物组织培养是基于植物细胞具有全能性这一理论，近几十年发展起来的一项植物体无性繁殖的新技术。通过本课程的学习，学生将掌握植物组织培养基制备、外植体接种、继代培养、移栽等相关知识和技能，初步具备植物组织培养的职业素养，为今后大学专业选择提供指导，奠定基础。本课程的成绩评定将由以下三部分组成：

1学生的课堂表现占20%，包括出勤率、课堂参与程度;2实验过程的规范性和实验成功率占50%;3学习撰写相应的小论文占30%。

3.2课程目标

1通过本课程的学习，能说出植物组织培养实验室常用的仪器、设备及用具的使用方法;明确植物组织培养工作的程序，说出无菌操作的原则;掌握培养基配制与灭菌、接种、培养及组培苗驯化移栽的方法;能分析实验操作过程中成败的原因。

2通过本课程的学习，能正确使用并维护植物组织培养实验室的仪器与设备;熟悉植物组织培养技术的程序，遵循无菌操作原则进行培养基的配制与灭菌、接种、培养及组培苗驯化移栽;能够按照培养对象正确选择有效的培养基，正确调控培养条件;成功培养一些植物器官。

3.3课程内容设计

从植物组织培养课程选题，将植物组织培养技术所需要的知识和技能进行整合和简化，使之适合我校现有的实验条件和高中学生能接受的程度，形成植物组织培养课程教学的两个课程单元，共整合为8个主题：单元一“植物组织培养基本操作技术”;单元二“植物组织培养实际应用技术”。这些主题覆盖了植物组织培养实验室内操作的全部过程，具体教学内容与学时分配如下。

单元一“植物组织培养基本操作技术”包括：

1植物组织培养的基本认识（共2个课时）——植物组织培养的概念、植物细胞的全能性、脱分化与再分化;

2植物组织培养实验及设备使用（共2个课时）——植物组织培养实验室的设置、常用设备仪器及使用、常用器皿的洗涤;

3培养基配制（共2个课时）——培养基的营养要求和环境要求、培养基的基本类型、母液的配制方法与培养基的配制;

4外植体接种（共2个课时）——如何选择外植体、外植体的表面灭菌、常用的表面灭菌剂、外植体接种。

单元二“植物组织培养实际应用技术”包括：

1矮牵牛茎尖组织培养（共2个课时）;

2烟草不定芽诱导及完整植株形成（共2个课时）;

3菊花茎尖与花瓣组织培养（共2个课时）;

4石斛植物离体快繁（共1个课时）。

学生实践参观，整理实验报告，整理小论文（2个课时）。另有1个课时作为机动安排。

3.4实验操作评价

在上述8个主题的教学活动中，每个学习小组必须完成四个方面的操作内容作为实验评价的依据，包括：

（1）每组学生每人能独立完成组培室的无菌操作，减少组培苗的杂菌感染率;

（2）每组分别配制大量元素母液1000mL、微量元素母液1000mL、铁盐母液1000mL、有机物母液500mL;

（3）选择1或2种外植体进行预处理，并完成外植体表面灭菌的任务;

（4）每组完成根、茎、叶外植体各20瓶培养基接种任务。

4植物组织培养实践——以矮牵牛为例

4.1培养基的配制

取出母液和植物生长调节剂溶液并按顺序放好。将洁净的各种器皿，如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在合适位置。取一只1L烧杯，放入约500mL蒸餾水，依次加入大量元素母液1（100mL）、微量元素母液2（10mL）、铁盐母液3（10mL）和有机物质母液4（5mL），并不断搅拌。加入琼脂（通常5.0～7.0g/L），加热使其完全溶解。加入30g蔗糖，待蔗糖溶解后加蒸馏水定容至1L。调整pH至5.6～5.8，用预先配好的氢氧化钠或盐酸进行调节。

4.2培养基的分装、灭菌

将1000mL培养基分装进灭菌后的20个小型培养瓶，每瓶约50mL培养基。将分装过后的培养瓶再次用高压蒸汽灭菌锅灭菌20min，灭菌后待高压锅压力下降到0Pa时取出，待培养基温度降至40～50°C时，在超净工作台上加入过滤除菌的生长调节物质，50mL培养基加0.1mL的NAA和0.1mL的6-BA，用移液枪取样，充分混合后静置凝固后再用。实验过程中需要用的无菌水、接种盘等可同时高压灭菌。

4.3对无菌接种间灭菌

每次接种操作前提前3h打开接种间的紫外灯消毒，把整个实验所需用到的实验材料和器材放到超净工作台内用紫外灯再灭菌数小时。超净工作台中放有接种器械灭菌器，实验过程中需要用到的镊子、剪刀等用具插入接种器具灭菌器（300°C）中灭菌。

4.4实验操作者的消毒

操作者进入接种室前，要在准备室内用温水和肥皂清洗双手并擦干，指甲缝内要用酒精特别消毒，不允许留长指甲。进入接种间前换上消毒好的接种服，在超净工作台里进行接种操作之前，用体积分数为70%的酒精擦拭双手。

4.5外植体的获取和接种

从已有的组培苗中剪取外植体，可以尽可能避免杂菌污染。植株不同部位的组织、器官中生理状态有很大不同，对培养基的反应也不同，因此选择合适的外植体对于实验能否成功很重要。外植体可分为带芽的外植体和分化组织构成的外植体，如带有侧芽的茎尖就是带芽外植体。对于大多数植物来说，茎尖无疑是较好的取材部位，因为其形态已基本形成，生长速度快，茎段侧芽或顶芽容易萌发。打开已有组培苗的培养瓶，取出矮牵牛小苗于接种盘中，用消毒并冷却的剪刀和镊子剪取矮牵牛茎尖的茎段，打开装有培养基的培养瓶，插入茎段并迅速盖上瓶盖，插入时注意茎段的方向，不要倒插。此过程中，如果是教师操作，可在酒精灯周围进行实验操作，接种完成后培养瓶口和瓶盖在火焰上过几圈可以更好地防止杂菌污染。如果是学生操作，可以不使用酒精灯，以免操作台内物品太多造成危险。使用过的器械可用无菌水冲洗后重新插入高温灭菌器灭菌，进行下一次操作。

4.6接种后外植体的培养、观察

待同一批接种完毕后，取出培养瓶并贴上标签，标注接种材料和日期，然后放入智能光照培养箱培养。温度设置为25°C，光照、黑暗各12h交替进行。实验记录显示3月7日接种15瓶矮牵牛，一星期后就有部分外植体长出了新芽，有两瓶发生了杂菌污染，其余长势良好.两周后，取出培养瓶移入光照培养架。4月7日观察时发现有一瓶矮牵牛已开出紫色小花。

5实验过程中的经验与反思

5.1成功经验总结

5.1.1取材的方法

按照植物的生长规律，在春夏季节取材，材料幼嫩，细胞分裂旺盛，室外气温适宜，组织培养容易取得成功;反之，秋冬季节进行实验，培养成功概率相对较低。

5.1.2培养基的配制

培养基配制的过程中，水浴加热时间太长，影响学生实验过程，所以可用700W微波炉高火加热7min，效果与水浴加热相同。高压灭菌时，玻璃培养瓶可灭菌25min，塑料培养瓶灭菌20min，灭菌时间过长会导致琼脂变质、不易凝固。灭菌结束后应立即把培养基取出放入超净工作台冷却，因为如果在高压灭菌锅中冷却，由于余温仍很高，培养基会变黄。

5.1.3超净工作台的使用

超净工作台在接种前关掉紫外灯，工作台拉门打开少许，等待2min，待臭氧气体排出后再进行操作，同时打开照明灯，风扇速度调至慢速。实验操作者双手伸入超净工作台，尽可能不要有着有衣物部分进入，双手及手腕处多用酒精棉球擦拭几遍。超净台中接种器械灭菌器内镊子温度很高，使用时需先取出冷却或没入无菌水冷却，避免烫伤外植体。

5.2困难与反思

我校改造的无菌室可放置3-4台超净工作台，可容纳的学生人数少。每次教学活动时，学生只能分批进行实验。学生操作培养的试管苗被污染率要明显高于教师培养的试管苗，说明学生进行操作时消毒跟灭菌过程中还不够彻底。目前成功接种了大量的矮牵牛、菊花、烟草苗，均是以茎尖为实验材料直接培养出了根和芽，而没见到愈伤组织。如需观察愈伤组织，则在MS培养基的基础上还需添加等量的0.2mg/mL的细胞分裂素和生长素，并进行暗培养，这还需进行进一步的探究。