利用SELDI-TOF-MS快速鉴定鲍曼不动杆菌的研究

解春宝，罗江蓉，黄文芳，传良敏，喻 华，杨永长，姜 伟，钟 敏，肖代雯

(四川省医学科学院·四川省人民医院 a.检验科，b.急诊科，四川 成都 610072)

鲍曼不动杆菌是一种非发酵的革兰阴性条件致病菌，存在于正常人的皮肤、呼吸道和泌尿道，也广泛分布于水及土壤。鲍曼不动杆菌具有强大的获得耐药性和克隆传播的能力，是引起医院内患者感染的最主要细菌[1]。该菌可引起身体各种组织或器官部位的感染，导致的疾病有软组织感染肺炎、菌血症、脑膜炎和尿路感染等[2]。鲍曼不动杆菌在全世界范围内备受关注。目前临床使用的传统细菌培养和基于生化反应来鉴定细菌是诊断细菌感染的最公认的方法，但传统的方法缺陷在于培养细菌时间较长、且容易受到接种时间和方法等因素的影响，较难达到对感染早期诊断的目的[3]。所以快速而准确的鉴定鲍曼不动杆菌非常重要。本研究利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)快速鉴定鲍曼不动杆菌。

1 材料与方法

1.1试剂与仪器普通血平板和麦康凯琼脂平板购自郑州安图公司；离心机购自美国BECKMAN COULTER；全自动微生物分析仪VITEK2 Compact购自法国梅里埃公司；蛋白分子量标准品、三氟乙酸(TFA)、芥子酸(SPA)和乙腈(ACN)购自美国Sigma公司；Proteinchip Software、SELDI-TOF-MS分析软件购自美国Ciphergen Biosystems；PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪和Au芯片购自美国Bio-Rad公司；2×Taq PCR masterMix和100 bp DNA Ladder购自北京康为世纪公司；GoldViewTM核酸染料购自北京赛百盛公司；引物由上海英俊公司合成。

1.2研究菌株收集我院2014年1～10月临床菌株：鲍曼不动杆菌60株、大肠埃希菌30株、肺炎克雷伯杆菌20株、产酸克雷伯菌8株、阴沟肠杆菌19株、奇异变形杆菌7株、枸橼酸杆菌4株、粘质沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌16株、金黄色葡萄球菌24株、溶血葡萄球菌16株。利用VITEK2 Compact自动微生物分析仪对所有菌株进行鉴定。

1.3方法

1.3.1菌株分组 将所有研究菌株分成训练组和验证组。训练组：鲍曼不动杆菌40株、大肠埃希菌20株、肺炎克雷伯杆菌10株、产酸克雷伯菌8株、阴沟肠杆菌10株、奇异变形杆菌7株、枸橼酸杆菌4株、粘质沙雷菌8株、摩根菌8株、表皮葡萄球菌10株、金黄色葡萄球菌14株、溶血葡萄球菌10株。验证组：鲍曼不动杆菌20株、大肠埃希菌10株、肺炎克雷伯杆菌10株、阴沟肠杆菌9株、表皮葡萄球菌6株、金黄色葡萄球菌10株、溶血葡萄球菌6株。

1.3.2细菌培养 由于所有收集菌株保存于-80 ℃冰箱，在研究前将菌株复苏后接种相应平板，在温度为35 ℃、CO2浓度为6.5%条件下对菌株培养24 h，然后取单个菌落转种平板，在相同条件下对菌株再次培养24 h，以便获得纯菌落。

1.3.3多重PCR鉴定鲍曼不动杆菌 利用ITS引物扩增鲍曼不动杆菌的间隔序列，将内参基因recA引物扩增不动杆菌属的高度保守序列。利用煮沸法提取DNA：挑取血平板上的菌落3～4个，加入300 μl双蒸水的1.5 ml EP管中，震荡混匀后在沸水中煮10 min然后以12 000转/min速度离心5 min，上清液即为模板DNA用于鲍曼不动杆菌基因测定。参照文献[4]设计多重PCR的引物，recA：F 5'-CCT GAA TCT TCT GGT AAA AC-3'，R 5'-GTT TCT GGG CTG CCA AAC ATT AC-3'，大小约为425bp； ITS：F 5'-CAT TAT CAC GGT AAT TAG TG-3'，R 5'-AGA GCA CTG TGC ACT TAA G-3'，大小约为208 bp。PCR反应体系为25 μl，包括：12 μl 2×Taq Master Mix，9 μl dH2O，ITS正反向引物各1 μl(10 μmol/L)，recA正反向引物各0.5 μl(10 μmol/L)，模板1 μl。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min，30循环周期(94 ℃变性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延生30 sec)，72 ℃ 3 min。PCR扩增出的产物在琼脂糖凝胶中电泳后用凝胶成像仪检测。同时扩增出的recA和ITS片段，确定为鲍曼不动杆菌。只扩增出recA，为其它种的不动杆菌。

1.3.4标本处理 从培养皿上收集纯菌落于装有灭菌水的1.5 mlEP管中，漩涡混匀，经10 000转/min离心5 min，弃去上清。在上一步的沉淀中加1 ml灭菌水混匀后10 000转/min离心5 min，弃去上清留下沉淀，充分混匀后备用。

1.3.5校准仪器 使用前需对质谱仪进行校准，标准品为：Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)、Myoglobin(MW16 950)。

1.3.6上样 取“1.3.4”部分处理好的细菌悬液4 μl与50%饱和SPA按照1：1比例混匀，将混匀好的标本点在AU芯片上，每个标本重复4次，在室温条件下干燥5 min。最后在每个样本孔中加入2 μlSPA(50%饱和)，等其干燥后进行仪器检测。

1.3.7数据采集和分析 利用蛋白芯片PBSⅡ-C型阅读机采集检测数据。设置仪器参数(激光强度190，检测敏感度为8)，利用Ciphergen proteinchip软件对检测结果数据自动收集。鲍曼不动杆菌和对照菌的差异蛋白峰用软件(BioMarker Wizard和BioMarker Pattern)进行分析，分析数据时参数设置：检测出有分析价值的蛋白峰出现的频率阈值(10%)，信噪比(S/N：7)，不同菌株中同一蛋白峰的偏差(<0.3%)，并构建分类树模型。利用构建的模型对20株鲍曼不动杆菌和51株非鲍曼不动杆菌进行验证，验证方法为盲法。

1.3.8AU芯片洗涤及验证 参照文献[3]对AU芯片进行洗涤及验证。

2 结果

2.1多重PCR鉴定鲍曼不动杆菌60株鲍曼不动杆菌在VITEK2 Compact鉴定后利用多重PCR方法能同时扩增出recA基因(425 bp)和ITS片段(208 bp)，以确定60株菌都是鲍曼不动杆菌。

2.2蛋白指纹图谱结果显示AU芯片能捕获近72个细菌蛋白峰，筛选出在两组之间差异明显的56个蛋白峰，见图1。选择其中M/Z为1 6737.8和5763.61的蛋白峰作为候选蛋白标志物。聚类分析的结果也显示M/Z为1 6737.8和5763.61的标志物表达差异最明显。

图1 鲍曼不动杆菌和对照菌的蛋白质谱图 横坐标为M/Z，纵坐标为蛋白表达的丰度。鲍曼不动杆菌 1～3为试验菌株，其余为对照菌。

2.3建立决策树诊断模型利用Biomarker Wizard获得研究数据，然后用BioMarker Pattern对数据进行分析处理，选择其中的差异蛋白峰构建其分类树模型。灵敏度在定于0.05的Gini决策分类树法。择优选出M/Z为1 6737.8和5763.61两个蛋白峰来构建鲍曼不动杆菌分类树模型，见图2。在第一个蛋白(M/Z：1 6737.8)节点，将149例样本分为两组，峰值强度≤4.589的样本划分到左边的终结点1，共105例，鉴定为对照组细菌；峰值强度>4.589的样本划分到右边的结点2，共44例。在第二个蛋白(M/Z：5763.61)节点，将44例结点2中的样本分为两组，峰值强度≤0.42的样本划分到左边的终结点2，共5例，鉴定为对照组细菌；峰值强度>0.42的样本划分到右边的终结点3，共39例，鉴定为鲍曼不动杆菌。

图2 鲍曼不动杆菌分类树模型

2.4AU芯片清洗及验证结果AU芯片经过一系列洗涤后检测发现，在分析临床菌株蛋白峰的范围内(相对分子量3000～30000 Da)无残留物质，提示本研究中洗涤芯片的方案良好，洗净的AU芯片可以再次使用，见图3。

图3 AU芯片洗涤后的检测结果

3 讨论

鲍曼不动杆菌作为条件致病菌，在自然环境中存在非常广泛。这种细菌有较强的抵抗力，一般的湿热、化学消毒剂、紫外线对该菌没有作用，而且该菌特点是定植发生率高、耐药性也很高[2]。鲍曼不动杆菌是导致院内感染的主要细菌之一，据文献[1，2]报道鲍曼不动杆菌在灼伤科、神经外科和重症监护病房(ICU)最为严重。鲍曼不动杆菌导致的感染病情严重且病死率较高，所以快速准确的鉴定鲍曼不动杆菌显得尤为重要。

传统的微生物的鉴定方法主要是基于微生物的形态特征，生理、生化以及分子生物学上，主要有细菌染色、形态、生长特征、动力试验、代谢产物检测、生化试验、血清学、核酸杂交、PCR以及动物实验等方法来鉴定细菌[3]。但是传统方法的缺点是耗时长、易受到接种时间及方法的影响，不能满足临床上早期的诊断和治疗，给患者身体和经济上带来极大的负担。

SELDI-TOF-MS技术是结合了蛋白质芯片和质谱技术的特点。这种方法的特点是：灵敏度高、通量高、可检出低丰度和低分子量蛋白。不同属种的细菌蛋白谱不同，相同细菌蛋白谱相似是该技术快速准确鉴定细菌的基础。早在2009年已有文献[5，6]报道采用该技术对临床分离的金黄色葡萄球菌和肺炎克雷伯杆菌可以进行快速而准确的鉴定。有其他文献[3，7～9]报道该技术能快速准确鉴定临床分离的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和伤寒沙门氏菌。

为了保证实验数据的准确性，首先利用多重PCR对全自动微生物分析仪VITEK-2鉴定的60株鲍曼不动杆菌进行分子生物学确认鉴定，可以确定60株菌均为鲍曼不动杆菌。其次采用蛋白分子标准品Insulin(MW5 733.49)、Cytochrome C(MW12 230)和Myoglobin(MW16 950)对质谱仪进行分子量校准，以及对芯片清洗后进行验证结果处理。本研究利用SELDI-TOF-MS技术对60株鲍曼不动杆菌和160株对照菌进行蛋白峰谱分析，共检测到72个蛋白峰(相对分子量3000～30000 Da)，其中筛选出有56个表达差异明显的蛋白峰。将蛋白峰数据导入BioMarker Pattern软件，择优选出两个蛋白峰(M/Z为1 6737.8和5763.61)构建鲍曼不动杆菌分类树模型。本研究中构建的鉴定模型简单，分两层3个叶结点，利用这两个差异蛋白峰鉴定鲍曼不动杆菌的正确率为97.5%，鉴定本实验中的对照菌正确率为100%。采用盲法(鲍曼不动杆菌20株、对照菌51株)进行了验证，其灵敏度和特异性分别为85%、100%。提示该模型的准确性、敏感性、特异性均较高。以上结果提示利用SELDI-TOF-MS可对鲍曼不动杆菌菌株进行快速而准确的鉴定。由于本文未纳入更过种属细菌和其他不动杆菌，故这两个蛋白峰(M/Z为1 6737.8和5763.61)构建的鲍曼不动杆菌鉴定模型还需要纳入更多菌株进行的验证。

SELDI-TOF-MS是基于核糖体蛋白的差异对细菌进行鉴定，属于表型分析。所以该技术对一些在进化过程中极其接近，即菌种间核糖体蛋白差异极小的细菌鉴别有一定的难度。且利用SELDI-TOF-MS建立的诊断模型每次只能鉴定一种细菌，故该技术暂时还没能在临床上进行广泛的应用，有待研究者进一步探索。