不同分子量风化煤腐殖酸对玉米植株主要代谢物的影响

周丽平，袁 亮，赵秉强，李燕婷，林治安

（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所/农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081）

腐殖酸是动植物遗骸经过微生物的分解和转化以及地球化学、物理的一系列变化过程而形成积累起来的一类具有多种官能团的大分子有机弱酸混合物。植物木质素及其转化产物多糖、蛋白质、脂质和核酸等都是参与该过程的重要组分[1]。因此，腐殖酸对植物生长发挥着重要作用[2-4]，研究表明，腐殖酸对植物生长发育的影响受分子量的影响较大。聚合程度低、分子量小的腐殖酸 (＜ 3.5 kDa) 更能提高根系H+-ATP酶的活性，以促进作物生长，这可能是因为小分子量腐殖酸易于被作物吸收，且含有较高含量的酸性官能团[5-6]。也有研究表明，聚合程度高、分子量大的腐殖酸 (＞ 3.5 kDa) 能提高玉米根系H+-ATP酶活性，从而提高质子泵活力，此外，大分子量腐殖酸具有较好的残留效应[7-8]。这些研究并未得到一致的结论。

目前，关于腐殖酸对玉米植株不同器官的碳水化合物、蛋白质和核酸等的相关研究多采用蒽酮比色法、Somogyi法、考马斯亮蓝染色法和PCR法等[9-12]，这些方法制样过程复杂、样品用量多、测试时间长，不利于快速、大量地进行植株样品分析和测定。傅里叶变换红外光谱 (FTIR) 是一种主要基于化合物中极性键振动的结构分析技术，它可通过特征红外吸收峰以及标准谱图库检索对样品中碳水化合物、脂类和核酸等官能团进行定性和定量分析。该方法具有灵敏度高、制样方法简单、样品用量少、测试时间短等优点[13-14]。前人已经将该技术用于作物养分胁迫、作物病虫害检测和吸附性能等的检测[15-18]，但鲜有研究用FTIR方法来检测腐殖酸处理下作物根、茎和叶各器官中主要代谢物的变化，而此方法若用于植株各器官的化学组分测定，可为高效筛选腐殖酸材料提供方法，为腐殖酸材料的进一步高效利用提供技术支持。

综上可知，腐殖酸的分子量大小可影响植物体的生长发育，但利用FTIR方法研究腐殖酸处理下植物体内不同器官的化学组分变化，尚未见到文献报道。本研究以玉米郑单958为供试作物，以来源较广的风化煤腐殖酸为试验材料，利用FTIR技术对玉米植株不同器官的主要代谢物进行分析，以研究不同分子量风化煤腐殖酸对玉米生长的作用机理，从而为风化煤腐殖酸影响玉米生长与生理代谢的机理研究提供参考，并为风化煤腐殖酸的进一步开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试夏玉米品种为郑单958 (Zea mays L.)。供试风化煤来自内蒙古棋盘井煤矿 (107°12'E、39°21'N，内蒙古自治区鄂尔多斯市)，腐殖酸 (HA) 是采用IHSS标准方法从风化煤中提取[19]，提取率为50.4%。供试腐殖酸的碳、氢、氧和氮含量分别为47.0%、4.89%、1.04%和33.6%。

1.2 试验设计

1.2.1 腐殖酸的分级 将腐殖酸样品 (HA) 采用超滤法按分子量 ＞ 50 kDa、10～50 kDa 和 ＜ 10 kDa 分为三个不同的级分，分别编号为HAH、HAM和HAL，基本元素特性如表1。

1.2.2 溶液培养试验 试验在中国农业科学院农业资源与农业区划研究所人工气候室进行，白天温度为28℃，夜间温度为20℃，光照强度为500 μ m o l/(m2·s)。所用营养液为霍格兰营养液[Ca(NO3)2·4H2O 1.18 g/L、KNO30.51 g/L、MgSO4·7H2O 0.49 g/L、KH2PO40.14 g/L、EDTA-Fe 0.036 g/L、H3BO32.86 mg/L、MnCl2·4H2O 1.81 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 mg/L、CuSO4·5H2O 0.08 mg/L、H2MoO4·4H2O 0.09 mg/L][20]。试验设不添加腐殖酸 (CK)和分别添加分子量 ＞ 50 kDa(HAH)、10～50 kDa(HAM) 和 ＜ 10 kDa(HAL) 腐殖酸碳 10 mg/L 四个处理。

玉米种子经70%的酒精表面消毒10 min，用蒸馏水洗净后，在蒸馏水中浸泡24 h，转移至石英砂中，在25℃下遮光环境中萌发3天，出苗后移入生长室。两叶一心时，精选出苗整齐的幼苗，去掉胚乳后移入盆钵中缓苗，每盆一株。缓苗营养液pH为6.0 ± 0.5 (用1 mol/L的NaOH溶液和1 mol/L的HCl溶液调节营养液pH)，2天后换成完全营养液，每隔一天更换一次营养液。试验设6次重复，随机区组排列。

表1 供试腐殖酸分子量、元素含量和摩尔比Table 1 Molecular weight, elemental contents and mole ratios of the tested humic acids

表2 添加不同分子量腐殖酸处理对玉米干生物量的影响Table 2 Dry biomass of maize as affected by humic acids with different molecular weight

1.3 测定项目及方法

1.3.1 干物质重 移苗20 d后，将玉米植株分为根、茎和叶，蒸馏水清洗后，于105℃下杀青30 min，65℃下烘干至恒重，称重。根冠比为根系干重与地上部干重的比值。

1.3.2 红外光谱分析 将烘干的玉米植株根、茎和叶磨碎后过0.2 mm筛，分别称取1 mg样品与200 mg溴化钾 (KBr)，放入玛瑙研钵中研磨均匀后进行压片，采用傅里叶变换红外光谱仪 (型号VERTEX 70，德国Bruker公司) 检测玉米植株根、茎和叶的光谱特征 (波数范围为400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次)。

1.4 数据处理与分析

试验数据采用Excel 2003和Origin 9.0软件进行处理和作图，采用SAS 9.1统计软件Duncan方法进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 腐殖酸处理对玉米干物质重的影响

添加腐殖酸可增加玉米根、茎和叶的干物质重，随着腐殖酸分子量的增加，各器官干物质重显著降低 (表2)。与对照相比，腐殖酸处理的玉米根、茎和叶的干物质重的平均值分别提高了91.07%、89.27%和88.53%。各腐殖酸处理之间比较，HAL处理的玉米根、茎和叶的干物质重最大，与对照相比，分别提高了143.14%、123.41%和150.54%，其次为HAM处理，HAH处理玉米的根、茎和叶的干物质重与对照相比，其提高幅度最小。

2.2 玉米根FTIR分析

腐殖酸处理下玉米植株主要基团及其FTIR的峰值位置见表3。

腐殖酸处理和对照处理的根系红外光谱的特征峰位置基本相同，但透射率不同 (图1)。腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 处理的玉米根系红外光谱在3420 cm-1和1655 cm-1波数附近的透射率明显低于对照，由此可知，添加腐殖酸可有效增加玉米根系碳水化合物、蛋白质、多肽和氨基酸类物质的含量，其中，添加低分子量腐殖酸效果最佳。

2.3 玉米茎FTIR分析

由图2可知，腐殖酸处理和对照处理玉米茎的红外光谱特征峰对应的波数基本相同。所有腐殖酸处理玉米茎的红外光谱在3420 cm-1和1655 cm-1波数附近的透射率均高于对照处理，低分子腐殖酸表现尤为明显。这表明，腐殖酸 (尤其是低分子量腐殖酸) 处理减少了碳水化合物、蛋白质、多肽和氨基酸类物质在玉米茎部的积累。另外，HAH和HAM处理在1250 cm-1波长附近的透射率要高于对照处理，而HAL处理在1250 cm-1波长附近的透射率低于空白对照，这表明HAH和HAM处理减少了核酸在玉米茎部的积累，HAL处理增加了玉米茎部核酸的含量。

表3 主要功能团、来源及其FTIR的峰值Table 3 Resource and wave length of main functional groups

图1 不同分子量腐殖酸处理玉米根系FTIR光谱图Fig. 1 FTIR spectra of maize roots under treatments of humic acids with different molecular weight

2.4 玉米叶FTIR分析

图2 不同分子量腐殖酸处理玉米茎FTIR光谱图Fig. 2 FTIR spectra of maize stems under treatments of humic acids with different molecular weight

图3 不同分子量腐殖酸处理玉米叶FTIR光谱图Fig. 3 FTIR spectra of maize leaf under treatments of humic acids with different molecular weight

由图3可知，所有处理玉米叶的红外光谱在3420、2920、1735、1655、1518、1380、1250 和1050 cm-1波数附近均有特征峰，腐殖酸各处理玉米叶的红外光谱在以上各波长处的透射率均低于对照处理，这说明，腐殖酸处理能够增加玉米叶片碳水化合物、酯类物质、蛋白质、多肽、氨基酸类物质和核酸等的含量。各腐殖酸处理之间比较，HAL处理在各波长处的透射率均为最低，这说明小分子量腐殖酸处理更容易增加玉米叶片的碳水化合物、酯类物质、蛋白质类物质和核酸等的含量。

3 讨论与结论

外源添加腐殖酸可促进玉米植株的生长发育，增加玉米根、茎和叶的干物质重。这主要是因为腐殖酸含有多种活性官能团，使其具有酸性、亲水性、界面活性、阳离子交换能力、络合作用及吸附分散能力[30-32]，从而促进作物根系对养分的吸收利用，并调控植物生长发育的原生代谢和次生代谢过程。另外，腐殖酸本身就是一种天然有机高分子混合物，可为植物的生长发育提供营养。还有研究表明，腐殖酸能够发挥生长素活性，促进H＋泵作用，降低细胞壁的pH值，激活细胞壁上的pH敏感酶和蛋白质，使细胞壁疏松，以使植物生长[33]。

不同分子量 (尤其是 ＜ 10 kDa分子量) 腐殖酸能够增加玉米根系碳水化合物、蛋白质、多肽和氨基酸类物质的含量，减少其在茎中的积累，增加玉米叶片碳水化合物、酯类物质、蛋白质、多肽、氨基酸类物质和核酸等的含量，从而促进玉米的生长发育。这可能是因为，腐殖酸 (尤其是小分子量腐殖酸) 可上调或下调某些基因，并通过复杂的转录网络影响植物的原生代谢过程，以影响不同器官蛋白质、碳水化合物和脂肪等的含量[5,34]。

小分子量 (＜ 10 kDa) 腐殖酸能更好地促进玉米的生长发育。这可能是因为小于10 kDa分子量腐殖酸因分子量低且含较高含量的羧基和酚羟基，因而具有更好的金属络合能力，从而改善了营养物同化和玉米代谢能力[35]。另外，腐殖酸本身就具有营养功能，＜ 10 kDa分子量腐殖酸更易于进入植物体内，促进植物生长。而大分子量 (＞ 50 kDa) 腐殖酸可能因具有较多稳定的结构和成分，有更好的残留效应[36]。Piccolo等的研究表明，只有小分子量腐殖酸表现出了类激素活性，并且分子量越小，类激素活性越大。此外，低分子量腐殖酸具有较高含量的酸性官能团，因此可促进植物的生长发育[5]，这一结论也解释了本研究结果，值得进一步研究。

总之，利用FTIR技术可揭示腐殖酸处理下玉米植株中不同器官组分的变化。腐殖酸处理能够增加玉米根系碳水化合物、蛋白质、多肽和氨基酸类物质的含量，减少其在茎中的积累，增加玉米叶片碳水化合物、酯类物质、蛋白质、多肽、氨基酸类物质和核酸等的含量，低分子量腐殖酸表现尤为明显。