不同产地、生长年限、采收期猪苓中三种有效成分的含量分析

2019-03-08郭宁武泽宇王建刚孙印石王弘

特产研究 2019年1期

郭宁，武泽宇，王建刚，孙印石，王弘※

（1.北京大学药学院，北京 100191；2.中国农业科学院特产研究所，长春 130112）

猪苓为多孔菌科真菌猪苓〔Polyporus umbellatus(Pers.)Fries〕的干燥菌核，性平、味甘、淡，是利水渗湿的传统中药[1]。猪苓的资源丰富，主要分布在我国陕西省、吉林省、云南省、山西省、甘肃省等地。已报道的猪苓中有效成分有甾体、多糖、氨基酸、蛋白质等[2]，其中，甾体类成分是猪苓的主要化学成分，主要包括麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮、猪苓酮等[3]，其中，麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮具有一定的利尿作用，《中国药典》（2015年）把麦角甾醇作为猪苓指标性成分[1]；猪苓多糖是猪苓的重要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、保肝、抗辐射等药理作用[4]。近年来，国内、外研究主要集中于猪苓的生物学特性、药理活性[5-9]及猪苓质量标准方面[10-11]，但较少涉及对不同产地、不同采收期猪苓的有效成分变化的研究，质量分析评价不是很完整。为此，本实验收集了不同产地的16 批猪苓药材和陕西略阳基地不同生长年限、不同采收期的猪苓药材进行麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及总多糖3 种成分的含量测定分析，建立了以猪苓3 种化学成分为指标的质量评价方法，为确定猪苓最佳的产地、最佳生长年限和采收期提供数据支持，为进一步扩大开发和利用猪苓资源提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AD 高效液相系统、AUW120D 分析天平（日本岛津公司）；旋转蒸发仪（RV 10 basic V，德国IKA公司）；TGL16 台式高速冷冻离心机（长沙英泰仪器公司）；TU-1800 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；超纯水仪（杭州华新净水有限公司）。

1.2 材料与试剂

麦角甾醇对照品（纯度>98%，上海源叶生物科技有限公司）；D-无水葡萄糖对照品（纯度>99%，中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯）、无水乙醇（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、蒽酮（分析纯）（北京化学试剂厂）；麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品（纯度＞98%，自制）。

猪苓为从全国不同地区收集的商品药材，栽培猪苓为陕西省略阳猪苓基地栽培的3年生、4年生及5年生猪苓药材。以上猪苓药材经北京大学药学院王弘副教授鉴定为多孔菌核真菌猪苓〔Polyporus umbellatus（Pers.）Fries〕的干燥菌核。猪苓药材粉碎过筛混合均匀后备用。

2 方法与结果

2.1 麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的高效液相色谱法（HPLC）测定

2.1.1 色谱条件色谱柱：Inert Sustain Swift C18（4.6 mm×250 mm，5m）；流动相：甲醇-水（94∶6）；检测波长：麦角甾醇281 nm、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮351 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；进样量：20L。在此色谱条件下，麦角甾醇对照品溶液及供试品溶液在281 nm 处色谱图见图1，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品溶液及供试品溶液在351 nm处色谱图见图2。

图1 麦角甾醇对照品（A）和猪苓药材供试品（B）HPLC 图Fig.1 HPLC Chromatogram of ergosterol reference substance(A)and sample(B)

图2 麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品（A）和猪苓药材供试品（B）HPLC 图Fig.2 HPLC Chromatogram of ergosterone-4,6,8(14),22-tetraen-3-one reference substance(A)and sample(B).

2.1.2 对照品溶液制备精密称取麦角甾醇2.5 mg，置50 mL 容量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，制成麦角甾醇0.05 mg/mL 的对照品溶液。

精密称取麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮2.7 mg，置250 mL 容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀。精密吸取1.5 mL溶液于25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀，制成6.48g/mL麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备精密称取猪苓粉末1.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加甲醇30 mL，称定重量，超声处理（功率220 W，频率100 kHz）60 min，放至室温，再称定重量，用甲醇补失重，摇匀，过0.45m滤膜，即得猪苓供试品溶液。

2.1.4 精密度试验精密吸取麦角甾醇对照品溶液、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品溶液各20L，连续进样6 次，计算麦角甾醇峰面积RSD 为1.20%，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮峰面积RSD为1.29%，说明仪器的精密度良好。

2.1.5 稳定性试验精密称取同一猪苓供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 按“2.1.1”项下色谱条件进行分析，计算麦角甾醇含量的RSD 为1.82%，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量的RSD为1.91%，表明猪苓供试品溶液在24 h 内稳定。

2.1.6 重现性试验精密称取6 份猪苓药材粉末各1.0 g，按“2.1.3”项下方法操作，制备猪苓供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定各猪苓样品的峰面积，计算麦角甾醇含量的RSD 值为1.36%，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量的RSD 值为1.59%，说明该实验方法具有较好重现性。

2.1.7 标准曲线和线性范围精密吸取麦角甾醇对照品溶液2L、8L、14L、20L、26L，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以麦角甾醇浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为横坐标得线性回归方程Y=3.4893×107X 4 011.303 6，R2=0.999 9。结果表明，麦角甾醇对照品在5.09～66.29g/mL 范围内线性关系良好。

精密吸取麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品溶液2L、8L、14L、20L、26L 注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以麦角甾醇浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为横坐标得线性回归方程Y=9.603 4×107X 580.464 3，R2=0.999 7。结果表明，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮对照品在0.06～8.42g/mL 范围内线性关系良好。

2.1.8 加样回收率试验精密称取已知含量的6 份猪苓药材样品各1.0g，分别加入麦角甾醇对照品0.7mg，按“2.1.3”项下方法操作，在上述色谱条件下进样测定，计算麦角甾醇的平均回收率为99.36%，RSD 为1.93%；麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的平均回收率为98.29%，RSD为2.15%，表明该实验的加样回收率良好。

2.1.9 样品测定精密称取不同产地猪苓粉末1.0g，共3 份，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件下测定，根据标准曲线计算各猪苓药材样品中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的含量，测定结果见表1。

表1 不同产地猪苓药材中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮和总多糖含量Table 1 Determination of ergosterol,ergosterone-4,6,8(14),22-tetraen-3-one and polysaccharide in from different regions

样品编号Sample number收集产地Region麦角甾醇含量（mg/g）Ergosterol麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮（ g/g）Ergosterone-4,6,8(14),22-tetraen-3-one 1甘肃省天水市Tianshui,gansu province 0.35 1.24 2吉林省长春市Changcun,jilin province 0.59 4.85 3陕西省城固县Chenggu,shanxi province 1.00 6.47 4河南省亳州市Bozhou,henan province 1.17 5.18 5陕西省凤县Feng,shanxi province 1.14 5.84 6陕西省宝鸡市Baoji,shanxi province 1.11 12.70 7山西省吕梁市Lüliang,shanxi province 0.96 18.70 8陕西省安康市Ankang,shanxi province 1.02 8.51 9陕西省汉中市Hanzhong,shanxi province 1.07 13.68 10 甘肃省陇南市Longnan,gansu province 1.10 7.75 11 云南省昭通市Zhaotong,yunnan province 0.91 8.31 12 陕西省平利县PIngli,shanxi province 0.95 17.54 13 云南省泸西县Luxi,yunnan province 1.04 18.87 14 甘肃省陇西县Longxi,gansu province 0.89 16.79 15 山西省汾西县Fenxi,shanxi Province 1.10 8.91 16 河北省临城县Lincheng,hebei province 1.41 9.49

表1 结果显示，16 批猪苓药材样品中测得的麦角甾醇含量为0.35～1.41 mg/g，其中，河北省临城县猪苓药材中麦角甾醇含量最高（1.41 mg/g），陕西省凤县、河南省亳州市、陕西省宝鸡市、陕西省汉中市、陕西省平利县、山西省吕梁市也相对较高（0.95～1.17 mg/g），吉林省长春市、甘肃省天水市猪苓的麦角甾醇含量较低，不符合2015年《中国药典》规定[1]。经过综合分析，陕西产地的猪苓药材中麦角甾醇含量较高。

16 批猪苓药材样品测得的麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量为1.24～18.87g/g，其中，云南省泸西县猪苓药材中麦角甾-4,6,8（14）, 22-四烯-3-酮含量最高（18.87g/g），山西省吕梁市、甘肃省陇西县、陕西省宝鸡市、陕西省汉中市、陕西省平利县也相对较高（12.70～18.70g/g），吉林省长春市、甘肃省天水市猪苓的麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量较低（1.24～4.85g/g）。综合分析，陕西产地的猪苓药材中麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量较高。

2.2 猪苓总多糖的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备和标准曲线的绘制称取葡萄糖对照品适量，置50 mL 容量瓶中，加超纯水溶解定容，摇匀，制成0.22 g/L 的葡萄糖标准品溶液。精密吸取葡萄糖标准品溶液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL，置10 mL 容量瓶中定容。精密吸取1mL置入具塞试管中，冰水浴中加入蒽酮显色剂4mL，沸水浴中加热10 min，再置冷水浴降至室温，于波长630 nm 处测定其吸收度。以葡萄糖的浓度为纵坐标、吸收度值为横坐标绘制标准曲线。结果表明，葡聚糖在0.02～0.22 mg 范围内呈良好的线性关系，回归方程为Y=0.159 2X 0.005 3，R²=0.999 5。

2.2.2 供试品溶液制备精密称定猪苓粉末1.0 g 置250 mL 圆底烧瓶中，加入100 mL 超纯水，称定质量。100 ℃回流提取60 min，放至室温后，再次称定质量，以超纯水补失重，滤过。精密量取滤液20 mL 置于50 mL圆底烧瓶中，减压浓缩至5 mL。加无水乙醇至体积分数为80%，摇匀，置4 ℃冰箱静置过夜（12h）。8 000 r/min离心10 min，取沉淀加80%乙醇5 mL洗涤1 次，离心，取沉淀物加水溶解，置25 mL 容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.2.3 精密度试验精密量取6 份0.22 g/L的葡萄糖对照品溶液，按“2.2.1”项下操作，测定吸光度值。结果，RSD 值为1.16%，说明仪器的精密度良好。

2.2.4 稳定性试验取同一供试品溶液，分别在显色0 min、15 min、30 min、45 min、60 min 后测定吸光度值，得RSD 值为1.89%，表明供试品显色后在60min 内稳定。

2.2.5 重现性试验取猪苓样品粉末1.0 g，按“2.2.2”项下方法操作，制备6 份供试品溶液。按“2.3.1”项下方法测定吸光度值，得RSD 值为1.45%，说明该试验重现性良好。

2.2.6 加样回收率试验精密称取已知含量的猪苓药材样品各1.0 g，共6 份，精密加入葡萄糖对照品9.00 mg，按“2.2.2”项下操作制备溶液，按“2.2.1”项下方法测定吸光度值，计算回收率。得平均回收率为104.49%，RSD 为1.04%，说明该实验的加样回收率合格。

2.2.7 样品测定精密称取3 份不同产地猪苓药材粉末各1.0 g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下方法测定吸光度值，根据标准曲线计算各猪苓药材中总多糖的含量。结果见表2。

表2 不同产地猪苓药材中总多糖含量Table 1 Determination of polysaccharide in from different regions

样品编号 Sample number 收集产地 Region 总多糖含量（%） Polysaccharide 1甘肃省天水市 Tianshui,gansu province 3.94 2吉林省长春市 Changcun,jilin province 4.99 3陕西省城固县 Chenggu,shanxi province 1.15 4河南省亳州市 Bozhou,henan province 0.91 5陕西省凤县 Feng,shanxi province 1.31 6陕西省宝鸡市 Baoji,shanxi province 0.96 7山西省吕梁市 Luliang,shanxi province 2.65 8陕西省安康市 Ankang,shanxi province 1.47 9陕西省汉中市 Hanzhong,shanxi province 1.03 10 甘肃省陇南市 Longnan,gansu province 1.63 11 云南省昭通市 Zhaotong,yunnan province 1.35 12 陕西省平利县 PIngli,shanxi province 1.01 13 云南省泸西县 Luxi,yunnan province 0.78 14 甘肃省陇西县 Longxi,gansu province 0.92 15 山西省汾西县 Fenxi,shanxi Province 0.79 16 河北省临城县 Lincheng,hebei province 1.04

由表2 结果显示，不同产地猪苓多糖含量在0.78%～4.99%，其中吉林省长春市猪苓药材中多糖含量最高（4.99%），甘肃省天水市、山西省吕梁市、陕西省安康市、甘肃省陇南市也相对较高（1.47%～3.94%），云南省泸西县、山西省汾西县猪苓的多糖含量较低（0.78%～0.79%）。综合分析，陕西地区猪苓药材的多糖含量较高。

2.3 不同生长年限猪苓中3种成分的含量比较

陕西略阳基地栽培的不同生长年限的猪苓中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及总多糖含量见表3。

表3 陕西略阳基地不同生长年限春季采收猪苓中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮和多糖含量测定结果比较Table 3 Determination of ergosterol,ergosterone-4,6,8(14),22-tetraen-3-one and polysaccharide in from different growth period in Lueyang,Shaanxi

样品编号Sample number生长年限Growth麦角甾醇含量（mg/g）Ergosterol平均值（mg/g）Average麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮（ g/g）Ergosterone-4,6,8（14）,22-tetraen-3-one平均值（ g/g）Average多糖含量（%）Polysaccharide平均值（%）Average 1 3年生 0.93 0.86 10.12 8.1 0.97 0.94 2 3 years old 0.86 7.15 1.16 3 0.79 7.02 0.69 4 4年生4 years old 1.09 1.01 15.07 10.96 0.90 0.92 5 1.06 8.01 1.17 6 0.89 9.80 0.68 7 5年生 1.06 0.93 12.02 9.53 1.12 1.02 8 5 years old 0.83 6.71 1.23 9 0.91 9.86 0.71

表3 结果显示，不同生长年限的栽培猪苓药材中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量在3～4年有上升趋势，在第4年的时候含量最高（麦角甾醇含量为1.01 mg/g，麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮含量为10.96g/g），第4年以后呈下降趋势。总多糖的含量在3～4年呈下降趋势，在第4年时含量最低（平均含量为0.92%），第5年又呈上升趋势，在第5年时达到最高（1.02%）。

2.4 不同采收时期猪苓中3种成分的含量比较

陕西略阳基地栽培猪苓采收时期不同，其麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及总多糖的含量也有差异，结果见表4。

表4 陕西略阳基地不同采收时期4年生猪苓中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮和总多糖含量测定结果比较Table 4 Determination of ergosterol,ergosterone-4,6,8(14),22-tetraen-3-one and polysaccharide in from different harvest period in Lueyang,Shaanxi

样品编号Sample number采收季节Harvest period麦角甾醇含量（mg/g）Ergosterol平均值（mg/g）Average麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮（mg/g）Ergosterone-4,6,8（14）,22-tetraen-3-one平均值（mg/g）Average多糖含量（%）Polysaccharide平均值（%）Average 1春季采收 1.13 1.06 15.19 11.34 0.93 0.98 2 Spring production 1.14 8.98 1.23 3 0.91 9.86 0.79 4 秋季采收Autumn production 1.09 1.01 15.07 10.96 0.90 0.92 5 1.06 8.01 1.17 6 0.89 9.80 0.68

结果显示，陕西略阳基地栽培的不同采收时期的猪苓药材样品中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及多糖含量春季采收比秋季的采收高，分别为1.06 mg/g、11.34g/g、0.98%。

3 讨论

3.1 不同产地猪苓药材的质量存在一定的差异

16批不同产地的猪苓药材中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及总多糖含量存在较大差异。麦角甾醇的含量以河北省临城市的猪苓药材最高（1.41 mg/g），麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的含量以云南省泸西市猪苓药材中最高（18.87g/g），总多糖的含量以吉林省长春市猪苓药材中最高（4.99%），陕西地区猪苓药材的麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及多糖含量都普遍高于其他产地，陕西猪苓药材的质量较好。

猪苓多糖是猪苓的有效成分之一，具有增强免疫力、抗肿瘤的作用；麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮是最强的具有利尿活性的成分，《中国药典》2015 版[1]却未规定猪苓多糖及麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的含量限度，因此，仅以麦角甾醇为指标成分不能全面反映猪苓药材的内在质量。为了更全面地衡量猪苓药材的质量，应测定猪苓中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮及总多糖3 种成分的含量。

3.2 应该科学合理地确定猪苓的生长年限

不同生长年限的猪苓3 种有效成分含量存在差异。随着年限的增长，猪苓药材中麦角甾醇、麦角甾-4,6,8（14）,22-四烯-3-酮的含量增加，但第4年以后开始降低；总多糖的含量随着年限的增长先降低后增加，这与郭顺星[12]和李江林等[13]的报道一致。不论野生或家种菌核的生长发育均靠蜜环菌侵染来为自身提供营养，蜜环菌多侵染2年以上的菌核，所以，蜜环菌侵染后猪苓菌核体内生理活动必定产生重大的变化，其代谢产物的质与量也可能随之改变。所以，保证猪苓适宜的生长年限能确保有效成分的高效利用。