江苏省6个翘嘴鳜群体的遗传多样性分析

2019-03-08颜元杰曹哲明丁炜东邴旭文

海洋渔业 2019年1期

颜元杰，曹哲明，丁炜东，邴旭文,

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，江苏无锡 214081)

翘嘴鳜(Sinipercachuatsi)属鲈形目(Perciformes)，真鲈科(Percichthyidae)，又被称为鳜鱼、桂花鱼[1]。翘嘴鳜是中国特有的淡水鱼类之一，其性凶猛，属于食肉性鱼类[2]。翘嘴鳜主要分布在中国的江河湖泊中[3]，喜欢栖息在底层，且翘嘴鳜肉质鲜嫩，具有丰富的营养[4]。翘嘴鳜肌肉含有丰富的蛋白质，可达到17.56%，且脂肪含量极低，仅有1.50%，是一种优质的高蛋白鱼类[5-6]。随着翘嘴鳜养殖业异常迅速的发展，随之也带来各种问题，主要表现在近亲交配和种质退化上，而且翘嘴鳜的疾病爆发也日趋严重[7-9]。为了保护江苏省野生翘嘴鳜的种质资源和选育出优良的翘嘴鳜品种，需要对江苏省野生鳜鱼群体进行遗传多样性研究。

关于翘嘴鳜种质资源的研究已有报道。李国庆[10]用RAPD分子标记对广东和湖南的养殖翘嘴鳜群体进行遗传多样性分析，结果表明2个翘嘴鳜养殖群体的遗传多样性都较低，需要对翘嘴鳜种质资源进行保护。刘峰等[11]对3种鳜(翘嘴鳜、大眼鳜Sinipercakneri、斑鳜Sinipercascherzeri)的GH基因进行了多态性检测分析，结果表明翘嘴鳜与大眼鳜亲缘关系比较近。方展军等[12]从60个随机引物中筛选出55个对野生翘嘴鳜和养殖翘嘴鳜进行群体内分析，结果表明野生翘嘴鳜群体具有较高的遗传多样性，野生翘嘴鳜群体和养殖翘嘴鳜群体之间有明显的遗传差异，表明人工繁育对翘嘴鳜的基因造成了显著的影响。

微卫星标记(microsatellite)即简单序列重复(simple sequence repeats，SSRs)，重复序列由1～6个核苷酸组成，并相互串联组成SSR核苷酸序列[13-15]。SSR序列包括两部分，分别为核心序列和侧翼序列，核心序列有高度的突变型，而侧翼序列相对保守，因此可根据其保守性设计微卫星引物，并利用PCR扩增来检测微卫星多态性[16]。微卫星标记具有位点数量多、多态性丰富、保守性高和共显性遗传等优点，所以被广泛应用于遗传多样性分析、亲缘关系鉴定、种质资源鉴定和遗传图谱构建等多个领域[17-19]。目前，应用微卫星标记技术已经在鱼类种质资源研究中取得了一定的进展。周莉等[20]用8对微卫星引物对异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)进行遗传多样性分析，结果表明其中的7对微卫星引物具有多态性和稳定性，适用于异育银鲫遗传多样性研究。吴旭等[21]用10个微卫星标记对长江中下游不同地理种群翘嘴鳜进行了遗传多样性分析，结果表明江湖阻隔是造成翘嘴鳜种群遗传分化的原因之一。MCCONNEL等[22]利用4个微卫星位点对新斯科舍、加拿大、挪威和爱尔兰4个地域的大西洋鲑(Salmosalar)进行遗传多样性研究，结果表明这4个微卫星位点具有丰富的多态性，能够作为大西洋鲑的遗传标记。FERGUSON[23]用微卫星技术对冰岛的赤眼鳟(Squaliobarbusourriculus)群体进行遗传多样性分析，结果表明冰岛赤眼鳟的遗传多样性比其它地区的赤眼鳟低，显示出了不同地区赤眼鳟群体遗传多样性的差异。梅秋兰等[24]开发了20对微卫星引物并筛选出16对多态性微卫星引物，对翘嘴鳜原种群体和养殖群体进行了遗传多样性分析，结果表明翘嘴鳜养殖群体的遗传多样性比原种群体低。鲁双庆等[25]利用20对微卫星引物对翘嘴鳜、大眼鳜、斑鳜和暗鳜(Sinipercaobscura)进行物种鉴定分析，结果表明翘嘴鳜与暗鳜的亲缘关系最近。

翘嘴鳜作为水产养殖业中重要的经济品种之一，对其野生自然群体遗传多样性的研究，不仅可以为翘嘴鳜的遗传选育提供优良的品种，而且能够对野生翘嘴鳜群体进行合理有效的种质资源保护。关于江苏省野生翘嘴鳜种群的遗传多样性分析尚未见报道，因此本研究通过SSR标记对江苏省6个野生翘嘴鳜群体进行遗传多样性分析，旨在为翘嘴鳜种质资源研究和翘嘴鳜育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用的翘嘴鳜分别来自太湖、滆湖、洪泽湖、高邮湖、骆马湖和长江镇江段，共50尾，其中太湖9尾、滆湖9尾、洪泽湖8尾、高邮湖9尾、骆马湖9尾、长江6尾。分别取各个体的鳍条样，冻干-80 ℃保存(图1)。

图1 江苏省翘嘴鳜采样地理位置图Fig.1 Sampling locations ofSiniperca chuatsi in Jiangsu Province

1.2 DNA的提取

将翘嘴鳜鳍条样品剪碎，并用研钵研碎。取0.1g研碎组织加入500 μLSTE缓冲液(150 mmol·L-1NaCl，50 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA)，12.5 μL10%SDS，10 μL蛋白酶K(20mgm·L-1)均匀混合。将混合物在55℃恒温下消化4 h，用苯酚和氯仿萃取后用等体积的异丙醇进行沉淀，12 000 r·min-1离心10 min后再用70%乙醇洗涤两次，用30 μL蒸馏水进行溶解。溶解之后用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性，并保存于4℃冰箱中备用。

1.3 微卫星引物

根据NCBI网站上的翘嘴鳜核酸序列设计了100对微卫星引物，送往上海博尚生物技术有限公司合成，合成后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离筛选出了20对高多态性的引物(表1)。

1.4 PCR反应及电泳分析

构建PCR反应25 μL体系：1 uL50 ng·μL-1DNA，上、下游引物各0.5 μL，2.5 μL10×buffer(Mg2+)，2 μLdNTPMix，0.25 μLTaq，18.25 μL ddH2O。PCR扩增反应体系：95℃预变性2 min；95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃继续延伸1 min；最后置于4℃下保存。用琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，然后用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的条带。待电泳结束后，用硝酸银进行染色，染色结束后进行显色，显色完成后用相机拍照并读取目的条带基因型，确定等位基因片段大小。

表1 20对微卫星引物的序列和特征Tab.1 Sequences and characteristics of 20 microsatellite primers

1.5 数据统计和分析

用popgene32(Version 1.32)软件统计所有位点的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)，以及各群体之间的遗传相似度和遗传距离。利用genepopV4.0软件进行哈迪温伯格平衡测试，检验不同种群各位点是否平衡。用PIC-CALC软件分析多态信息含量(PIC)。用NTsys软件构建不同群体的UPGAM亲缘关系树。调查近3年江苏省各大湖泊和长江的翘嘴鳜放流增殖数据并记录。

2 结果与分析

2.1 6个翘嘴鳜群体的遗传多样性分析

用经过筛选的20对翘嘴鳜微卫星引物对5湖1江的6个野生翘嘴鳜群体共50个个体进行遗传多样性分析。实验发现，每对引物都能稳定扩增出明显微卫星条带，且条带清晰(图2)。

在20个位点中总共获得839个等位基因，每个位点的等位基因为5～9个，且5湖1江的翘嘴鳜群体在每个位点上都表现出了多态性。其中长江翘嘴鳜群体的平均有效等位基因为6.524 8、平均期望杂合度为0.922、多态信息含量为0.827 3，在6个翘嘴鳜群体中最高。相反，太湖翘嘴鳜群体的平均有效等位基因为4.862 3、平均期望杂合度为0.836 9、平均多态信息含量为0.761 9，在6个翘嘴鳜群体中最低(表2)。

2.2 哈迪温伯格平衡测试

在所有6个野生翘嘴鳜群体的20个微卫星位点的Hardy-Weinberg测试中，骆马湖、滆湖、太湖和长江的所有位点都符合哈迪温伯格平衡。而在洪泽湖中，S16位点处于不平衡(P<0.05)；在高邮湖中，S6位点显著不平衡(P<0.01)(表3)。

2.3 5个湖翘嘴鳜群体的遗传相似度和遗传距离

5湖1江翘嘴鳜群体的遗传相似度和遗传距离见表4。由表4可知，太湖翘嘴鳜群体和滆湖翘嘴鳜群体之间的遗传距离(0.062 8)最小，遗传相似系数(0.939 1)最高，说明太湖翘嘴鳜群体和滆湖翘嘴鳜群体之间亲缘关系比较近。洪泽湖和高邮湖翘嘴鳜群体之间遗传距离(0.084 2)也比较小，两者之间的亲缘关系也比较近。相反，骆马湖翘嘴鳜群体和太湖翘嘴鳜群体之间的遗传距离(0.509 6)最大，遗传相似系数(0.600 7)最低，其亲缘关系也最远。此外，长江与5个内陆湖中的高邮湖翘嘴鳜群体的遗传距离(0.115 9)最小，表明与其亲缘关系最近。

图2 S6引物在6个翘嘴鳜群体中的微卫星扩增结果Fig.2 Amplification results of S6 primers in 6 Siniperca chuatsi groups in the microsatellite注：1～9：骆马湖群体；10～18：滆湖群体；19～27：太湖群体；28～36：高邮湖群体；37～44：洪泽湖群体；45～50：长江群体； M：Takara 的DNA markerNote：1～9: Loma Lake group; 10～18: Gehu Lake group; 19～27: Taihu Lake group; 28～36: Gaoyou Lake group; 37～44: Hongze Lake group; 45～50: Yangtze River group; M: Takara DNAmarker

遗传多样性参数Genetic diversity parameter骆马湖Loma Lake滆湖Gehu Lake太湖Taihu Lake高邮湖Gaoyou Lake洪泽湖Hongze Lake长江Yangtze River平均有效等位基因(Ne) Mean effective allele4.887 04.863 24.862 34.9395.143 46.524 8平均观测杂合度(Ho) Mean observed heterozygosity 0.612 50.722 20.738 90.744 40.811 10.808 3平均期望杂合度(He) Mean expected heterozygosity0.838 50.837 90.836 90.838 90.850 70.922 0平均多态信息含量(PIC) Mean polymorphism information content0.762 70.762 60.761 90.762 80.776 70.827 3

表3 6个翘嘴鳜群体所有位点的哈迪温伯格平衡测试Tab.3 The Hardy-Weinberg equilibrium test of all loci in 6 Siniperca chuatsi populations

注：*表示连锁不平衡(P<0.05)；**表示显著不平衡(P<0.01)

Note:*indicates linkage imbalance(P<0.05);**represents a significant imbalance (P<0.01)

表4 6个野生翘嘴鳜群体之间的遗传距离和遗传相似度Tab.4 Genetic distance and genetic similarity among 6 wild populations of Siniperca chuatsi

注：对角线上方为遗传相似系数，对角线下方为遗传距离

Note: The genetic similarity coefficient is above the diagonal line, and the genetic distance is below the diagonal line

2.4 聚类分析结果

根据表4的6个野生翘嘴鳜群体的遗传相似系数和遗传距离，对这6个群体进行UPGMA聚类分析，结果显示高邮湖和洪泽湖翘嘴鳜群体先聚为一类，然后和长江聚为一类；另外滆湖和太湖聚为一类。由于高邮湖与洪泽湖之间相互连通，且长江与高邮湖之间也相互连通，故水域之间的连通有可能是影响其聚类的原因(图3)。

图3 6个野生鳜鱼群体之间的UPGMA聚类分析Fig.3 UPGMA cluster analysis among 6 wild populations of Siniperca chuatsi

2.5 翘嘴鳜的放流数据记录

根据2015—2017年江苏省各个湖泊的翘嘴鳜放流数据，结果显示所有湖泊和长江中只有高邮湖和洪泽湖在3年中每年都放流了翘嘴鳜(表5)。

表5 江苏省各个湖泊近3年翘嘴鳜的放流记录Tab.5 Release records of Siniperca chuatsi from lakes of Jiangsu in recent three years

3 讨论

3.1 江苏省翘嘴鳜群体的遗传多样性

微卫星标记具有高度的多态性，与其它分子标记相比它能更多的揭示群体的遗传变异水平，因而微卫星标记被广泛应用于群体遗传多样性的研究[26-27]。本研究筛选了翘嘴鳜的20个微卫星引物，对江苏省5湖1江的野生翘嘴鳜的基因进行扩增，经检测确定，扩增产物的目的条带明显。群体遗传多样性水平的大小主要体现在杂合度和多态信息含量上，若其数值越大，则遗传多样性越丰富[28]。TAKEZAKI等[29]通过对微卫星标记的研究发现，当杂合度处于0.3以上时就表明群体具有遗传多样性。BOTSTEIN等[30]通过对多态信息含量的研究发现，若多态信息含量超过0.5，即说明其具有丰富的多态性。鲁双庆等[25]通过对湖南省洞庭湖野生翘嘴鳜群体的遗传多样性研究表明，洞庭湖野生翘嘴鳜群体的平均期望杂合度为0.64，平均多态信息含量为0.535 5。在本研究中，江苏省5个内陆湖和长江的野生翘嘴鳜群体的平均期望杂合度都在0.8以上，平均PIC也都在0.7以上，均高于鲁双庆等[25]的研究结果，说明江苏省野生翘嘴鳜群体的遗传多样性高于湖南省洞庭湖的野生翘嘴鳜群体。

3.2 翘嘴鳜群体间的亲缘关系

群体间亲缘关系的远近主要通过群体间的遗传相似系数和遗传距离来判断。群体间的遗传相似度越大表明亲缘关系越近。当遗传相似系数大于0.5时，群体间的亲缘关系就属于一级亲缘关系[31]。从实验结果可以看出，6个翘嘴鳜群体互相之间的遗传相似指数都符合了一级亲缘关系的标准。其中，太湖翘嘴鳜和滆湖翘嘴鳜两个群体间的遗传相似度最大，为0.939 1，骆马湖翘嘴鳜与太湖翘嘴鳜两个群体的遗传相似度最小，为0.600 7。亲缘关系的远近有可能与地理位置有关，朱滔等[32]通过对赤壁、常德和怀化3个地域的野生翘嘴鳜群体遗传多样性研究表明翘嘴鳜群体间的亲缘关系和翘嘴鳜群体的地理位置分布相关。在本研究中，太湖与滆湖之间的距离最近，所以遗传相似度最大，亲缘关系最近，而太湖与骆马湖的距离最远，亲缘关系也最远，这与朱滔等[32]的研究结果一致，表明了相同物种之间的亲缘关系与地理位置的分布相关。

3.3 哈迪温伯格平衡分析及放流影响

哈迪温伯格定律是指在理想状态下，各等位基因的频率和等位基因的基因型频率在遗传中是稳定不变的，即保持着基因平衡[33-34]。在该研究中，所有种群的位点中只有2个位点上偏离了平衡(P<0.05)，分别是S6位点和S16位点，洪泽湖和高邮湖分别在这两个位点上表现出了不平衡和显著不平衡，表明了洪泽湖和高邮湖的翘嘴鳜群体出现了遗传不平衡。从近3年翘嘴鳜的放流数据可以看出，只有洪泽湖和高邮湖放流了翘嘴鳜，但放流的数量不是很大且高邮湖比洪泽湖放流稍微多一些，这与位点不平衡相对应，因为放流数量少，所以只有两个位点出现了不平衡，说明翘嘴鳜的放流会影响当地翘嘴鳜野生群体的遗传结构，导致了遗传不平衡。把翘嘴鳜放流数据与遗传多样性相结合起来分析，除长江野生翘嘴鳜群体特别高以外，另外5个湖都相差不多，其中高邮湖和洪泽湖稍高，而恰恰高邮湖和洪泽湖进行了翘嘴鳜放流，这进一步说明翘嘴鳜的放流有可能会影响水域翘嘴鳜野生群体的遗传多样性。