基于GC-MS技术对甘肃陇南大红袍花椒挥发油柠檬烯 芳樟醇含量的测定△

司昕蕾，蔡秀荣，曹瑞，边甜甜，辛二旦，牛江涛，张爱霞，李越峰*

1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃省中药质量与标准研究重点实验室，甘肃 兰州 730000 3.兰州佛慈制药股份有限公司，甘肃 兰州 734000

花椒为芸香科植物青椒ZanthoxylumschinifoliumSieb.et Zucc或花椒ZanthoxylumbungeanumMaxim的干燥成熟果皮[1]。花椒的香气成分来自于其组织中所含的挥发油，其挥发油是由萜烯等有机化合物及其含氧衍生物醇、醛、酮、酯等成分组成，是一种挥发性的油状物质[2]。甘肃省陇南市武都区是中国名特优经济林花椒之乡，其所产的花椒具有粒大饱满、麻味醇厚、药效成份多、挥发油含量高等特点[3]。柠檬烯、芳樟醇在花椒中含量较高，是花椒的特征性成分[4]，测定甘肃陇南大红袍花椒挥发油中柠檬烯、芳樟醇可有效的控制其质量。近年来GC-MS技术经常用于挥发油、挥发性成分定量及鉴定研究[5-7]，遂本文采用GC-MS测定及鉴定甘肃陇南大红袍花椒挥发油中柠檬烯、芳樟醇。

1 材料

1.1 仪器及设备

HY-04 型高速粉碎机(上海菲力博宝业公司 型号：LFP-500A)；万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司 型号：AL104)；HH-S 型恒温水浴锅(余姚市检测仪表厂)；7890A-5975C 型气相色谱-质谱联用仪，FID检测器，HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，MSD化学工作站，NIST1谱库，GC-MS数据分析工作站。棕色容量瓶，玻璃棒，离心管，移液管，移液枪；一次性使用无菌注射器(湖北康友医用器材有限公司 规格：1 mL)；0.45 μm微孔滤膜。

1.2 试剂

正己烷(色谱纯 天津市大茂化学试剂厂)，哇哈哈纯净水。

1.3 对照品

柠檬烯(20 mg，北京北纳创联生物技术研究院 批号：180109)；芳樟醇(20 mg，北京北纳创联生物技术研究院 批号：170912)。

1.4 药材

陇南大红袍花椒，采购自甘肃省陇南市，药材经甘肃中医药大学鉴定教研室王明伟教授鉴定符合2015版《中华人民共和国药典》一部规定。

样品预处理：样品粉碎过30目筛。

2 方法

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品母液制备 分别精密称取柠檬烯和芳樟醇20.00 mg，分别置于5.0 mL容量瓶中，用正己烷定容，得标准品储备液[8]。

2.1.2 供试品溶液制备 采用水蒸气蒸馏法，分别称取花椒粉末20.00 g，于1000 mL的具塞锥形瓶中，加入10倍量的水与沸石数粒，振摇混合后，连接挥发油测定器与回流冷凝管自冷凝管上端加水使充满挥发油测定器的刻度部分，并溢流人烧瓶时为止。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸约5小时，至测定器中油量不再增加，停止加热，放置片刻，开启测定器下端的活塞，将挥发油缓缓放出。取挥发油30 μL加正己烷定容至10 mL，再用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试品[9]。

2.2 进样条件

2.2.1 色谱条件 HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。载气为氮气，载气流量为1.0 mL·min-1。程序升温，起始温度60 ℃，保持2 min，以3 ℃·min-1升温至165 ℃，然后以20 ℃·min-1升温至280 ℃，保持5 min。进样量1μL，分流进样，分流比为10∶1；汽化室温度为250 ℃[10]。

2.2.2 质谱条件 EI 离子源，电压70 eV，温度230 ℃；四级杆质量监测器，温度150 ℃；扫描范围m/z：40～500 amu；溶剂延迟4 min。

2.3 含量测定

2.3.1 线性关系考察 精密吸取上述对照品母液加正己烷稀释，得到柠檬烯的浓度系列为：0.16、0.24、0.32、0.48、0.56、0.64、0.8 mg·mL-1，芳樟醇的浓度系列为：0.32、0.40、0.48、0.56、0.64、0.80、0.96 mg·mL-1；按“2.2.1”项下的色谱条件分别进样，以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得柠檬烯、芳樟醇的标准曲线。

2.3.2 样品含量测定 按“2.2.1”项下方法测定供试品溶液，在上述色谱条件下分析，用面积外标法计算花椒中柠檬烯、芳樟醇的含量。

2.4 方法学考察

2.4.1 重复性试验 取同一批号陇南大红袍花椒粉末6份，按“供试品溶液的制备”方法，对样品分别制备12份供试品溶液，分别在上述色谱条件下进样，测定乙酸芳樟酯的含量。

2.4.2 稳定性试验 精密吸取0.7 mg·mL-1的对照品溶液0.2 μL在0、2、4、6、10、12、24 h进样，测定乙酸芳樟酯的含量。

2.5 成分鉴定

将制备所得提取液经0.45 μm微孔滤膜过滤之后，用微量进样器进样1 μL。经过质谱数据系统检索(质谱数据库NTST)，鉴定陇南大红袍花椒挥发油成分。

3 结果

3.1 线性关系考察

结果表明，柠檬烯进样浓度在0.16～0.80 mg·mL-1时，响应值与浓度呈良好的线性关系，响应值与浓度的回归方程为Y= 5×108X-2×107，相关系数为r= 0.999 8；芳樟醇在0.32～0.96 mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，响应值与浓度的回归方程为：Y= 4×108X-5×108相关系数为r=0.999 5。

3.2 样品含量测定

图1 甘肃陇南大红袍花椒挥发油气相色图谱

图2 柠檬烯气相色谱图

图3 芳樟醇气相色谱图

Group柠檬烯芳樟醇Sample 10.35 0.95 Sample 20.37 1.03 Sample 30.36 0.97 Sample 40.41 1.14 Sample 50.39 0.89 Sample 60.33 1.39 Sample 70.40 1.23 Sample 80.42 1.29 Sample 90.32 0.87 Sample 100.44 0.89 Sample 110.34 1.21 Sample 120.32 0.95

取12批甘肃陇南大红袍花椒经粉碎过筛后，分别按“2.3.2”项下方法测定柠檬烯、芳樟醇的含量。结果表明甘肃陇南大红袍花椒中芳樟醇含量(1.07%±0.16%)略高于柠檬烯含量(0.37%±0.04%)。

3.3 方法学考察

3.3.1 重复性试验 测得甘肃陇南大红袍花椒中芳樟醇含量均值为1.03%，RSD为0.08%；柠檬烯含量均值为0.37%，RSD为0.03%结果表明重复性良好。

3.3.2 稳定性试验 结果芳樟醇含量的RSD=0.79%，柠檬烯含量的RSD=0.81%，稳定性良好。

3.4 成分鉴定

图4 柠檬烯质谱图

图5 芳樟醇质谱图

经过质谱数据系统检索(质谱数据库NTST)，鉴定陇南大红袍花椒挥发油成分为柠檬烯、芳樟醇。

4 结论

根据陇南大红袍花椒挥发油成分为柠檬烯、芳樟醇的测定结果发现，其芳樟醇含量略高于柠檬烯，且芳樟醇、柠檬烯含量较高，可以用来快速、简便控制其花椒质量。花椒挥发油用正己烷稀释较甲醇、乙醇稀释效果好，其测定峰在此条件下分离度、峰形好。芳樟醇是花椒中重要的香气成分之一，具有抗菌、镇静、除臭、杀虫等功效，柠檬烯含量青花椒中为0.013%，红花椒中为0.014%；芳樟醇的含量在青花椒中为0.072%，红花椒中为0.008%[11]，从这两个指标来看，陇南大红袍花椒中的柠檬烯、芳樟醇含量均高于红花椒和青花椒，这可能是引起陇南大红袍花椒与青花椒、红花椒香味差异的重要原因。