遵义地区3种野生食用菌的分离与鉴定

孟庆峰, 张 旭, 祝伦伟, 付少彬

(1.遵义医学院 公共卫生学院,贵州 遵义 563100；2.遵义医学院 药学院,贵州 遵义 563100)

食用菌是高等真菌中可供人们食用的大型真菌(又称蕈菌)[1]。有研究表明，我国发现的野生食用菌已超过2 000种，其中，驯化栽培的种类超过100种，商品化的种类超过60种，而商品化的野生食用菌中常见的有平菇、香菇、金针菇、杏鲍菇、木耳等[2-4]，仅占食用菌的3%。可见，目前我国野生食用菌具有很大开发潜力。贵州生态环境良好、气候条件适宜，野生食用菌资源是全国最丰富的地区之一。在食用菌的鉴定中，常依据食用菌的形态进行确定，即通过观察子实体或培养后观察菌落形态及个体显微特征，将标本及菌种鉴定到门、纲、目、科、属、种。但随着科学技术的发展，有关学者发现，有些食用菌会随着生长环境的不同而表现出不同的形态学特征。笔者等对采于遵义地区的3种野生食用菌进行传统的形态描述鉴定，并进行了组织分离和分子生物学鉴定，以准确判断其品种和系统地位，为开发和利用该野生食用菌提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌 3种野生食用菌采自贵州省遵义汇川区团泽镇鸡公山,编号分别为X-01，X-02，X-03。

1.1.2 培养基 1) 配制麦芽汁:取50 g麦芽，磨碎，在45℃水浴中0.5 h，然后升温到70℃,保持1 h，向其加水至400 mL。2) 培养基配制：20%马铃薯汁500 mL，麦芽汁100 mL，葡萄糖15 g，维生素B 150 mg，琼脂20 g，蒸馏水加至1000 mL，pH 5.5左右。

1.1.3 试剂与仪器设备 试验所用的试剂及仪器设备见表1和表2。

表1 主要试剂

表2 主要仪器设备

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 借助体视显微镜对食用菌子实体进行外部形态学观察，光学显微镜对食用菌的孢子、菌丝特征进行观察并描述。

1.2.2 菌种的分离与培养 组织分离法：在无菌条件下，先用酒精棉球对菇体进行表面消毒，然后手持菌柄，将菌撕成两半，取手术刀经火焰灭菌、冷却后，在菌盖、菌柄交界处挑取一小块菌肉，移植到PDA培养基上于25℃培养，待菌丝长出，挑取菌丝纯化，再置于25℃恒温培养箱中培养。

孢子释放法：在无菌条件下，先用酒精棉球对菇体进行表面消毒，然后除去菌柄，将菇直立，菌盖朝上放于无菌培养皿中过夜，待孢子长出，对其进行分离、纯化，再将其放入25℃恒温培养箱中培养。

1.2.3 分子生物学鉴定 从子实体组织和菌丝中提取DNA，按照真菌基因组DNA提取试剂盒操作，PCR扩增体系见表3，1%琼脂糖凝胶电泳检测，将成功获得的PCR产物送北京博友顺生物技术有限公司测序；将上述获得的序列通过NCBI、BLAST，找出与之同源性最大的序列并运用MEGA7建立系统发育树。PCR反应程序：预变性 94℃ 3 min；变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，20 个循环；延伸72℃ 10 min，4℃ 保存。

表3 PCR反应体系

2 结果与分析

2.1 子实体特征

3种食用菌的子实体见图1。X-01：子实体呈伞状。菌盖呈钟形至平展，直径约7 cm，中部稍微凸起，灰褐色，表面干燥，有的边缘平滑，有的龟裂。菌肉为白色，受伤后变为灰白色；菌褶灰白色，稍密，弯生，不等长。菌柄为圆柱形，长约5 cm，粗约1.2 cm，表面光滑，白色，受伤后变为灰褐色，内部松软至中空，基部稍膨大。基物为土壤。X-02：子实体呈耳状。菌盖呈漏斗形，直径约为4 cm，中部下凹，边缘上翘，表皮颜色为黄褐色，表面干燥、有些许鳞片；菌肉为白色，受伤后变为灰色；菌褶为黄白色，致密，长约2 cm，延生，不等长。菌柄较短，约2.5 cm，圆柱形，灰白色，丛生，内部较为中空，基部略微膨大。基物为梨树。X-03：子实体呈圆筒形。菌盖近圆锥形，长约7 cm，宽约5 cm，表面有许多凹坑，似羊肚状，凹坑近圆形或不规则形，颜色淡黄色或黄褐色，交织成网状；菌柄长约6 cm，粗约5 cm，中空，基部膨大，基物为土壤。

图1 3种食用菌的子实体

Fig.1 The fruiting bodies of three wild edible fungi

2.2 菌丝及孢子特征

经过反复的分离、纯化得到3种野生食用菌菌丝，在培养基上，X-01号菌菌丝为白色、带有玫红色，浓密、呈绒毛状，产生玫红色的色素，爬壁能力较强，一般7 d菌丝长满；X-02号菌菌丝为白色、绵毛状、较为稀疏，不产生色素，爬壁能力弱，一般13 d菌丝爬满；X-03号菌菌丝为黄色、绒毛状、浓密，产生黄褐色色素，后期有菌核生成，爬壁能力强，一般4 d菌丝长满。

由图2和图3看出，X-01号食用菌孢子为单个、浅绿色、近球形，大小约为9 μm×9 μm；菌丝粗细较均匀，有分叉，锁状联合。X-02号食用菌孢子为单个、淡绿色、椭圆形，大小约为7 μm×2 μm；菌丝粗细不匀，有分叉，锁状联合。X-03号食用菌子囊近柱形，有8个孢子、单行排列，孢子无色、为椭圆形，每个大小约为5 μm×8.5 μm；菌丝粗细均匀，有隔，无锁状联合。

图2 3种食用菌的孢子形态特征

Fig.2 Morphological characteristics of spore of three edible fungi spores

图3 3种食用菌的菌丝形态特征

Fig.3 Morphological characteristics of hyphae of three edible fungi spores

2.3 PCR扩增

从图4看出， 6条条带的片段大小均为500～800 bp。

注：从左至右，条带依次为3条子实体和3条菌丝体。

Note: The band in the following order: Tree fruiting bodies; tree myceliums.

图43种野生食用菌子实体及其菌丝的琼脂糖凝胶电泳图谱

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of three species of wild edible fungi and their mycelium

2.4 分子鉴定结果

将测序结果与GeneBank比较，X-01号菌子实体测序结果与晶盖粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]的同源性为98%；菌丝与南海海洋真菌(Fusariumsp)的同源性为99%,子实体的序列结果与表性特征一致，最终以子实体的结果为准，系统发育树见图5。X-02号菌子实体和菌丝分子鉴定结果均与漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]的同源性为99%，系统发育树见图6。X-03号菌子实体结果与柳毒蛾(Leucomacandida)的同源性为77%；菌丝与冠状虫霉(Conidioboluscoronatus)的同源性为95%，子实体和菌丝的序列与表型均不符合，所分离的菌株可能是附着在表面的杂菌，而子实体序列可能是PCR产物直接测序其目的片段，最终以表型特征为主进行鉴定。

X-01号食用菌分类地位：真菌界(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina) ，层菌纲(Hymenomycetes) ，伞菌目(Agadcales) ，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌属(Rhodophyllus)，晶盖粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]。

X-02号食用菌分类地位：真菌界(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌属(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch:Fr.) Ames]。

X-03号食用菌经过表型特征鉴定为羊肚菌属，分类地位：真菌界 (Eumycota)，子囊菌亚门(Ascomycotina)，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌属(Morchella)。

图5 X-01号菌子实体系统发育树

Fig.5 The phylogenetic tree of the mycelium system X-01

图6 X-02号菌子实体系统发育树

Fig.6 The phylogenetic tree of the mycelium system X-02

3 结论与讨论

采用孢子释放法和组织分离法分离野生食用菌，通过显微镜对3种野生食用菌的子实体、菌丝和孢子形态特征进行观察，分子生物学方法对其子实体和菌丝进行基因组DNA提取、ITS区测序，综合形态学特征和ITS基因序列，鉴定X-01号为真菌界(Eumycota)，担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agadcales)，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌属(Rhodophyllus)，晶盖粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]；X-02号为真菌界，担子菌亚门，无隔担子菌亚纲(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌属(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]；X-03号为真菌界，子囊菌亚门(Ascomycotina)，盘菌纲(Discomycetes)，盘菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌属(Morchella)。

孢子释放法比组织分离法的效率高，但是与时间、孢子成熟程度关系较大。采用传统的形态特征对其进行鉴定，方法虽然简便、快速、直观，但仍存在很多不足，有些食用菌的形态特征会随着生长环境的变化而变化，进而不能完全准确地对食用菌进行分类。因此，分子生物学手段广泛地应用于未知真菌的鉴定，在食用菌分类上取得了成功，如田慧敏等[5]成功确定了赤峰5种未知真菌的分类学地位。然而，虽然结合分子学方法能更快速地确定食用菌的分类学地位，但也有试验表明，单从分子生物学的结果并不能准确地确定食用菌的类别，如刘晓婷等[6]对1株白桩菇进行鉴定时，在形态学和分子学的结果上出现了很大的差异，综合考虑后从形态学的角度确定其为白桩菇属。试验中X-01、X-03号食用菌的分离鉴定中也出现了此现象。