高活性漆酶菌株 6BS筛选及其对染料脱色的影响

刘 学， 王金家， 王艳杰， 于文浩， 邢鑫蕊， 汪春蕾

(东北林业大学 生命科学学院， 黑龙江 哈尔滨 150040)

漆酶是属于蓝色多铜氧化酶家族的多酚氧化酶[1]。其能通过氧气氧化一些芳香族化合物，同时将分子氧还原为水[2-3]。漆酶在自然界中普遍存在[4]。其中，细菌和真菌漆酶的应用价值较大，在纸浆造纸、污水处理、木材加工、能源、环保、生物合成领域均有重要应用[5]。

据统计，世界上的染料至少10%排放到水体中[6]，其组分复杂、有机物含量高、难降解且毒性强[7]，不仅对水生动植物造成危害，还对人体健康产生严重危害。目前，处理染料废水的方法主要有3种。物理法和化学法具有成本高昂[8]、废液处理不彻底的缺点[9]，而生物法则具有效率高、能耗低、投资少和环境友好等特点，成为了近年来研究的热点。

细菌漆酶具有较多的优点，如热稳定性较强，pH适应性较广，对NaCl和一定浓度的多种有机溶剂具有较强的耐受性[10]，因此在印染废水的染料脱色处理中起重大作用。但当染料底物的氧化还原电势比漆酶高或底物太大以致无法接近漆酶的催化位点时，介体与漆酶组成的漆酶介体系统可协助漆酶完成反应，介体因结构的不同而通过电子传递、氢原子传递或离子氧化而起作用[11]。

为寻找可用于染料废水生物处理的高效菌株，特从东北林业大学实验林场的土壤中分离、筛选出1株具有较高漆酶活性的菌株，对该菌株进行鉴定，研究该菌株的生理、生长特性，并研究不同类型介体对芽孢漆酶脱色偶氮、蒽醌、靛蓝及三苯甲烷类染料的影响，以期为工业染料废水的处理提供优良菌株和理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1样品样品土壤取自东北林业大学实验林场。

1.1.2主要试剂Taq DNA Polymerase、EescherichiacoliJM109感受态细胞和细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司，DNA Marker DL2000、dNTP(2.5 mmol/L)、pMD18-T载体购自TaKaRa公司，16S rDNA通用引物27F和1492R由华大基因公司合成。丁香醛连氮、结晶紫、靛红、活性黑和RBBR均购自Sigma公司，细菌微量生化反应管购自杭州滨和微生物试剂有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2产漆酶菌株的筛选及纯化

用Cu2+为筛选剂纯化出单克隆菌株，并以丁香醛连氮为底物，筛选出颜色呈深红色且具有较高漆酶活性的菌株[12]。

1.3菌株的形态学观察及生理生化特性测定

对菌体进行革兰氏染色并观察其形态，并利用生理生化反应管测定其糖类发酵等生理生化反应特性[13]。

1.4菌株的16S rDNA基因克隆及系统发育树的构建

参照细菌基因组DNA提取试剂盒上提取方法提取细菌总DNA。利用细菌的通用底物27F，5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′ (M=A+C)和1 492R，5′-TACGGYTACCTTGT TACGACTT-3′

(Y=C+T)[14]克隆菌株的16S rDNA基因。PCR反应体系：灭菌蒸馏水7.7 μL，10×PCR buffer(含15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L的dNTP 1.6 μL，2.5 μmol/L的引物各4 μL，DNA模板0.5 μL，5 U/μL Taq 酶 0.2 μL，加ddH2O补至20 μL。PCR反应条件：93℃预变性5 min；94℃变性18 s，56℃退火15 s，72℃延伸78 s，30个循环；72℃延伸7 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后检测。

用B型小量DNA片段胶回收试剂盒回收PCR产物，将胶回收产物与pMD18-T连接，将连接产物转化到E.coliJM109感受态细胞中，37℃培养40 min后，将菌液涂布含有氨苄青霉素的平板上，37℃培养过夜。将菌落PCR鉴定为阳性的转化子送到华大基因有限公司进行16S rDNA测序。测定结果在NCBI的BLAST上进行比对，利用Clustalx软件进行多序列比对，通过Phylip-3.69软件中最大简约法构建该菌株的系统发育树[15]。

1.5菌株的生物学特性分析

研究温度(20～50℃)、pH(3～10)、NaCl质量分数(1%～10%)、铜离子浓度(0～6 mmol/L)对菌株生长的影响(表1)。菌株在LB培养基中活化后，按2%接种量接种于不同条件的LB液体培养基中，基本培养条件为30℃，120 r/min培养12 h，测其OD600nm值，3次重复，取平均值。

表1菌株生物学特性的分析条件

1.6不同介体对菌株的芽孢漆酶脱色染料的影响

菌株芽孢漆酶液的制备方法参考文献[16]，染料脱色体系包括0.1 mmol/L介体、染料、1 mg/mL芽孢漆酶液以及0.1 mol/L、pH=7.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液。所用的介体为乙酰丁香酮(AS)、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和丁香醛(SA)。所用的染料为雷马素亮蓝R(RBBR)、活性黑、靛红和结晶紫，染料的类型、终浓度及最大吸收波长见表2。并设不加介体的染料脱色对照组。40℃，160 r/min脱色2 h、4 h和6 h后分别取样，14 000 r/min离心2 min后，用分光光度计测定各种染料最大吸收波长处的吸光值，重复测定3次，取平均值计算染料的脱色率，脱色率(%)=(A0-A)/A0×100%。式中，A0为初始染料吸光值，A为不同时间取样时测的吸光值。

表2染料类型、终浓度及最大吸收波长

Table 2 Type, final concentration and maximum absorption wavelength of four dyes

染料名称Dye name染料类型Dye type终浓度/(mg/L)Final concentration最大吸收波长/nmMaximum absorption wavelengthRBBR蒽醌100591活性黑 Reactive black偶氮40597靛红 Isatin靛蓝25610结晶紫 Crystal violet三苯甲烷5583

1.7数据处理

利用Excel计算3次重复数据的染料脱色率、脱色率的平均值和标准差，并利用SPSS软件对不同介体对染料脱色率的影响进行显著性分析(P<0.05)。

2结果与分析

2.1具有漆酶活性菌株的筛选及分离

经筛选对丁香醛连氮显深红色的编号为6BS的菌株进行后续研究。

2.2菌株6BS 的形态学观察及生理生化特性

菌株6BS在LB固体培养基上37℃培养24 h，菌落乳白色，较小，圆形不透明，表面干燥，质地粗糙，菌落边缘呈现羽毛状，革兰氏染色呈蓝紫色，短杆状，为革兰氏阳性细菌。菌株6BS能利用甘露糖、蔗糖和葡萄糖作为碳源，不能利用阿拉伯糖、蜜二糖、木糖醇、山梨醇和枸橼酸盐，不产生精氨酸双水解酶，菌株6BS属于发酵型菌株。

2.3菌株6BS 的16S rDNA基因克隆及构建系统发育树

菌株6BS的16S rDNA基因经克隆后测序共1 513 bp，在GenBank上提交序列获得注册号为MH127533。经比对该菌株与多种芽孢杆菌的同源性达99%。结合菌株6BS形态学、生理生化特性以及16S rDNA同源性比对结果，鉴定该菌株为芽孢杆菌属细菌，命名为Bacillussp. 6BS。由图1可见，系统发育树中菌株6BS与Bacillussubtilis关系最近。

图1基于16S rDNA序列菌株6BS 的系统进化树

2.4菌株6BS 的生物学特性

菌株6BS的最适生长温度为37℃，在20～50℃均能生长(图2A)，最适生长pH为8.0，在pH5.0～9.0长势很好(图2B)，菌株6BS在含1%～2%NaCl的培养基中生长旺盛，能够耐受5%的NaCl(图2C)，菌株6BS对Cu2+的耐受性较强，小于0.4 mmol/L的Cu2+对菌株生长无影响，其能耐受2 mmol/L的Cu2+(图2D)。

图2不同条件下菌株6BS 生长的OD值

2.5不同介体对菌株6BS 芽孢漆酶脱色染料的反应

不加介体的条件下脱色6 h，菌株6BS的芽孢漆酶对三苯甲烷类染料结晶紫(图3A)和蒽醌类染料雷马素亮蓝R(图3B)的脱色率较高，分别达到92.12%和70.64%。与不加介体的对照组相比，介体乙酰丁香酮能显著提高芽孢漆酶对靛蓝类染料靛红，偶氮类染料活性黑和蒽醌类染料雷马素亮蓝R的脱色率，介体2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物能显著提高芽孢漆酶对雷马素亮蓝R、靛红和活性黑的脱色率，丁香醛能显著提高芽孢漆酶对靛红和活性黑的脱色率(图3C、D)。乙酰丁香酮、2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和丁香醛这3种介体对结晶紫脱色率无显著影响，表明芽孢漆酶对结晶紫的脱色机制与其他3种染料不同。

注：结晶紫(A)、RBBR(B)、靛红(C)和活性黑(D)的影响，不同小写字母表示不同介体的影响在0.05水平上差异显著。

Note: A, Crystal violet; B, RBBR black; C, Isatin; D, Reactive. Different lowercase letters indicate significance of difference atP< 0.05 level.

图3不同介体对菌株6BS芽孢漆酶脱色染料的反应

Fig.3 Response of different mediators to dye decolorization by spore laccase of strain 6BS

3结论与讨论

菌株6BS具有耐铜性，能耐受2 mmol/L的Cu2+，易于分离和筛选，与菌株4BS的耐铜特性相似[17]，均优于菌株CLb[18]、菌株WD23[19]和菌株9BS[20]对Cu2+的耐受性。Cu2+是漆酶催化中心的辅助因子，对于漆酶表达后的折叠与组装起重要作用，Cu2+能提高漆酶活性，是漆酶活性必须的辅助因子[17]。菌株6BS耐铜性对其应用于废水治理有重要意义。

本研究中，芽孢漆酶位于菌体的芽孢中，芽孢漆酶对染料的脱色是菌体和芽孢漆酶共同作用的结果。细菌表面具有各种活性基团能够吸附染料，细胞壁和细胞膜等组分也对染料有吸附能力[21]。芽孢漆酶可以通过O2催化多酚类物质，因大多数染料分子中含有酚类结构单元，故可被脱色[22]。但漆酶对一些染料的脱色效果较差，引入介体后，漆酶提高染料的脱色效率。漆酶氧化还原电势低是限制漆酶活性的主要因素，而且也不能直接作用于高氧化还原电势的底物。介体其实是一些分子量低、低氧化还原电势的化合物，在漆酶的作用下易得失电子形成活性高且稳定的中间体，并作用于底物，使其被氧化[23]。本研究中，菌株6BS的芽孢漆酶对三苯甲烷类染料结晶紫的脱色率较高，加入3种介体后，并无显著提高芽孢漆酶对结晶紫的脱色率，表明芽孢漆酶对结晶紫的脱色主要是菌体的吸附作用，结晶紫的氧化还原电势低，加入介体也未能增加其脱色效果。而加入介体乙酰丁香酮和2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物均能显著提高菌株6BS的芽孢漆酶对靛红、活性黑和雷马素亮蓝R的脱色率，加入介体丁香醛能显著提高菌株6BS的芽孢漆酶对靛红和活性黑的脱色率。介体共分为3类，有天然介体如乙酰丁香酮和丁香醛、合成介体如2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物和其他类介体。天然介体不仅来源易、花费少且对环境友好[24]。在本研究中天然介体AS有显著作用，是染料脱色中值得推荐的介体。

该研究结果表明：以Cu2+为筛选剂，以丁香醛连氮为底物，筛选出具有较高漆酶活性的菌株6BS，鉴定其为芽孢杆菌属的细菌，故命名为Bacillussp. 6BS。菌株6BS能耐受5%NaCl和2 mmol/L Cu2+。天然介质乙酰丁香酮、丁香醛，合成介质2,2,6,6,-四甲基哌啶氧化物2种介体均能显著提高菌株6BS的芽孢漆酶对靛红和活性黑的脱色率。