硝化抑制剂对稻田土壤N2O排放和硝化、反硝化菌数量的影响

李 杰，石元亮，王玲莉，孙 毅，李 忠，魏占波，石淏心

（1 中国科学院沈阳应用生态研究所，辽宁沈阳 110016；2 吉林农业大学资源与环境学院，吉林长春 130033）

水稻是世界上主要的粮食作物，是50%人口的主要口粮。据统计，2017年我国水稻播种面积为3020万hm2(4.53亿亩)，约占全国粮食播种总面积的26.1%[1]。提高水稻综合生产能力，是保障我国粮食安全的长期战略目标。氧化亚氮(N2O)是导致全球气候变暖的重要温室气体之一[2]。虽然大气中N2O的浓度远低于二氧化碳(CO2)，但其增温潜势却是CO2的296倍[3]。为了获得水稻高产，中国农田化肥的投入量在持续增加。淹水种植条件下的稻田土壤利于反硝化作用的发生，导致N2O的产生和排放。研究结果显示我国水稻田N2O排放量约占农田总排放量的22%，被认为是大气中N2O的重要排放源之一[4]。因此，减少稻田温室气体排放已成为农业排放源中的研究热点。

目前，为了提高肥料利用率和保护稻田生态环境，人们通过在肥料中添加硝化抑制剂来减少氮素损失。市场化的硝化抑制剂主要有两种，双氰胺(DCD)和3, 4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)。DCD和DMPP的作用机理不同，DCD主要通过干扰AOB对底物的利用来影响硝化作用，而DMPP则通过引起亲核取代活性和降低相邻N的pKa来影响硝化作用[5]。大量研究表明DCD和DMPP在不同类型农田和草地土壤中均能很好地抑制硝化作用过程，减少N2O排放和硝酸盐淋溶[5-7]。但是，目前硝化抑制剂在长期淹水条件下的北方水稻黑土中对硝化作用影响和作用机理的研究尚不多见。因此，评估硝化抑制剂对水稻土壤的硝化抑制效果，对于减少温室气体排放和硝酸盐淋溶，实现氮肥的高效利用具有重要的意义。

本研究以寒地黑土区水稻土为研究对象，通过分子生物学手段探讨氮肥在土壤中的转化过程，硝化抑制剂DCD和DMPP对氮素循环关键功能微生物的抑制效果及其与氮素转化动态的联系机制。从而为水稻生产中氮肥合理施用，评估硝化抑制剂在北方水稻黑土上的应用效果和提高氮肥利用效率提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验土壤采自黑龙江省方正县水稻科技园区(116°23′E、39°54′N)的水稻土。土壤类型为草甸黑土，土壤有机质25.8 g/kg、碱解氮187.56 mg/kg、有效磷23.6 mg/kg、速效钾213 mg/kg，pH为6.1。土壤采集时间为2018年10月30日。将鲜土采回实验室后，剔除残留根系，过2 mm筛，25℃培养箱中预培养两周待用(将土壤放入培养容器中，不做任何处理，用以恢复土壤微生物活性)。供试氮肥为分析纯试剂尿素，硝化抑制剂双氰胺(DCD)和3, 4-二甲基吡唑磷酸盐(DMPP)均为分析纯，纯度分别为99.5%和97%。

1.2 试验设计

采用室内培养方法，尿素施用量为N 0.8 g/kg干土，DCD与DMPP添加量为尿素纯氮量的2%和0.5%。设置如下4个处理：对照(CK)；单施尿素处理(Urea)；尿素+DCD(Urea+DCD)；尿素+DMPP(Urea+DMPP)。

试验分为两部分。一部分土壤采用300 mL培养瓶装土，每瓶装100 g风干土(过2 mm筛)，调节水分至淹水条件，使土面上保持2～3 cm的水层(在整个培养时期)。将尿素和硝化抑制剂均匀施入到相应处理的土壤中，透气膜封口后25℃下恒温恒湿培养，每个处理4次重复。于培养的第1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、20、27、34、41、48、55、62、69、76、83、90、100、122、137、150天采集气体样品。另外一部分土壤采用植物培养皿装土，培养方法和条件同上。分别于1、3、5、9、16、23、30、37、44、59、73、90、100、122、150天破坏性采样。土壤样品一式两份保存，一份于-80℃保存，用于分子微生物分析；另一份于-20℃保存，用于速效氮测定。

1.3 项目测定

1.3.1 气体样品采集和测定方法 测定瓶内N2O含量时，先用空气泵置换瓶内空气，待空气置换干净后，用带有不锈钢针头的橡胶塞封口，针头处连接三通阀。25℃下密闭培养5 h后用注射器抽取35 mL瓶内气体，用安捷伦气象色谱仪(GC-7890A)自动进样并测定N2O含量。检测器为电子捕获器ECD，计算机程序控制1 mL定量管和十通阀自动进样，载气为高纯氮。分离柱温度、进样口温度和检测器温度分别为60℃、100℃和330℃。采样结束后用空气泵置换瓶内气体，以透气膜封口，置于25℃培养箱中培养，定期采样。

根据公式F=△m/(W×△t)=ρ×V×△C/(W×△t)计算N2O排放通量。式中：F为N2O排放通量；△t是密闭培养时间；△m和△C分别为△t时间内培养瓶中增加或减少的气体质量和混合比浓度；V和W分别是培养瓶内有效空间的体积和土样重量；ρ为标况下气体密度。

累积N2O排放量计算方法：用两次连续测量的N2O排放速率的均值乘以两次测量时期间隔的时间，最后累计相加[7-8]。N2O排放系数的计算公式为：N2O排放系数(EF，%)=施肥增加的土壤N2O排放总量(N kg/hm2)/ 施氮量(kg/hm2)×100。

硝化抑制剂对N2O排放的减排率计算公式为：硝化抑制剂对N2O减排率(%)=(添加硝化抑制剂处理N2O排放量-单施尿素处理N2O排放量)/单施尿素处理N2O排放量×100。

1.3.2 土壤指标测定方法 土壤pH采用pH计测定(水土比2.5∶1)；铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)含量采用2 mol/L KCl浸提(水土比5∶1)，流动分析仪测定(Auto AnalyzerIII，BRAN+LUEBBE，Germany)；碱解氮采用碱解扩散法；有效磷采用NaHCO3浸提—分光光度计比色法；速效钾采用醋酸铵浸提—火焰光度计法测定。

1.3.3 土壤分子生物学指标测定 土壤总DNA采用MoBio PowersoilTMDNA试剂盒(San Diego，CA，USA)提取，方法参照试剂盒说明书。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测所提D N A片段大小，并用NanoDrop核酸蛋白测定仪(ND-1000)测定DNA的浓度及质量[9]。

Real-time PCR检测：

1)引物 定量PCR的目标基因为总细菌16S rRNA基因；硝化过程相关基因为AOAamoA和AOBamoA，用二者的拷贝数分别表示AOA和AOB的数量；反硝化过程相关基因为nirK和nirS。目标基因的引物、出处、序列见表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2)反应体系amoA：5 ng DNA模板，上下游引物各100 nM，5 μL 2X SYBR®Premix ExTaqTM(Takara，日本)，双蒸水补至10 μL。nirK：2.5 ng DNA模板，上下游引物各150 nM，5 μL 2×SYBR®Premix Ex TaqTM(Takara日本)，双蒸水补至10 μL。16s rRNA基因：2.5 ng DNA模板，上下游引物各150 nmol/L，1 μL of 10×反应缓冲液，0.8 μL dNTPs(10 μmol/L)，0.25 μL 10×SYBR®Premix ExTaqTM(Takara日本)，0.5 U of HSTaq酶，双蒸水补至10 μL。

3)PCR扩增程序95℃预变性3 min；并在94℃变性30 s，60℃(退火温度视目标基因而定，见表1)30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃修复延伸8 min。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

4)标准曲线制备 分别构建细菌16s rRNA、amoA、nirK基因的质粒标准曲线，标准曲线的范围在102～108[14]。扩增效率和拷贝数通过下列公式计算：

1.4 数据分析与统计

数据采用SPSS 16.0中单因素方差分析(ANOVA)的Duncan检验进行差异显著性(P＜0.05)检验。用Sigmaplot 13.0软件作图[15]。

表1 定量PCR所用引物及PCR条件Table 1 Primers and conditions for RT-PCR

2 结果与分析

2.1 硝化抑制剂对土壤铵态氮、硝态氮含量的影响

与对照相比，施肥处理铵态氮和硝态氮含量均显著增加，并分别在第3天和第16天达到最大值(图1)。铵态氮在培养后的第23天左右降低至对照水平。在培养前23天内，与单施尿素处理相比，添加硝化抑制剂处理保持了较高的NH4+浓度。说明添加的硝化抑制剂DCD和DMPP均延缓了氨氧化过程，减缓了NH4+向NO3-的转化。与添加DCD的处理相比，添加DMPP处理的硝态氮浓度可在更长的培养时间内保持最低水平。

2.2 硝化抑制剂对N2O排放通量和总量的影响

研究结果显示，在尿素施用后，各施肥处理N2O排放迅速增加，在第4天时均达到峰值后快速下降。从图1可以看出，N2O排放主要集中在施肥后的前两周内。添加DMPP处理排放系数为0.05%，添加DCD处理为0.18%，添加DMPP显著低于添加DCD。添加硝化抑制剂DCD和DMPP均显著减少了N2O排放峰值和累积排放量，其减排率分别达到21.6%和78.3%(图1，表2)。

2.3 硝化抑制剂对AOB和AOA丰度的影响

图2显示，与CK相比，培养3天时，含尿素处理土壤AOB数量均显著增加；与单施尿素处理相比，培养3天时尿素+DCD处理土壤的AOB数量显著减少32.4%，但在培养30天时的AOB数量与单施尿素处理相当，培养90天时，AOB数量显著高于单施尿素处理。尿素+DMPP处理在培养第3、30和90天时，土壤中的AOB数量显著低于尿素+DCD处理。与单施尿素相比，尿素+DMPP处理对AOB数量的抑制率可达35%～58%(P＜0.05)。土壤AOA对施肥的响应与AOB相反。在整个培养期间，施加尿素的AOA数量并没有增加，反而显著减少。尿素+DMPP处理在培养前期能显著减少AOAamoA基因拷贝数，培养后期无显著抑制作用；而尿素+DCD处理AOA没有显著变化。

图1 添加不同硝化抑制剂土壤N2O排放通量、NH4+-N和NO3--N含量的变化Fig.1 Variation of N2O emission, NH4+-N and NO3--N contents in soils added with different nitrification inhibitors

2.4 硝化抑制剂对nirS和nirK基因丰度的影响

与对照相比，施肥处理能够显著增加nirK和nirS基因拷贝数(图3)，nirK基因拷贝数为nirS基因拷贝数的4.5～11.3倍。与单施尿素处理相比，尿素+DMPP处理在培养第3天和第30天nirS和nirK基因拷贝数均显著减少，DMPP在一定程度上影响了反硝化作用；DCD处理对nirS和nirK数量无显著抑制。

表2 添加不同抑制剂土壤N2O排放总量和排放系数Table 2 Total N2O emissions and emission factors in soils added with different nitrification inhibitors

图2 硝化抑制剂对氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度的影响Fig.2 Effect of nitrification inhibitors on abundance of AOB amoA(a)and AOA amoA gene(b)

图3 添加不同硝化抑制剂土壤中的反硝化基因nirS和nirK基因拷贝数Fig.3 Abundance of nirS and nirK gene in soils added with different nitrification inhibitors

3 讨论

本研究中所有施肥处理的N2O排放均主要发生在前两周，且在第4天时达到峰值，与前人[16-17]研究结果一致。尿素添加DCD和DMPP均能较长时间保持高含量的铵态氮，减缓硝酸盐的生成，从而实现N2O的减排。这说明硝化抑制剂DCD和DMPP可抑制水稻土壤中NH4+向NO3-的转化，减缓硝化作用过程，进而减少温室气体N2O的排放。尽管DMPP施用量是DCD的四分之一，但其对硝化作用的抑制效果要远远好于DCD。这可能是由于DMPP相对于DCD具有降解速度慢[17]、吸附力强等特点[17]，使其在土壤中硝化抑制效果可以保持更长久并且不易与NH4+分离[18]，也可能与不同硝化抑制剂的结构及作用机理有关[19]。

本试验结果表明，由于尿素水解后形成了氨，为氨氧化细菌提供了可以利用的底物，施用尿素显著刺激了氨氧化细菌(AOB)的生长[20]，但在培养第90天时，AOB数量显著下降，可能是因为培养前期土壤中氨氧化细菌的快速生长消耗除铵外的其他营养物质，抑制了后期氨氧化细菌的继续生长。此外，土壤中铵根离子在培养后期的大量减少也可能是造成氨氧化细菌数量下降的原因之一。与氨氧化细菌相反，氨氧化古菌(AOA)在施用尿素后，其数量不但没有增加，反而显著减少，说明AOB在土壤氨氧化过程中起主要作用。

本试验中，尿素与硝化抑制剂DCD和DMPP配施显著抑制了AOB的生长，但未对AOA有显著影响。Di等[20]研究也发现，添加DCD能显著减少土壤中AOB的数量，而AOA在牧场土壤中的数量在整个培养期间无显著变化。Li等[21]通过田间试验也发现与单施尿素相比，DMPP混施尿素处理能显著减少AOB数量，并且在两年时间内可使稻田AOB数量减少24.5%～30.9%。以上研究结果均表明，水稻土中的AOB对硝化抑制剂非常敏感，而AOA对硝化抑制剂DCD和DMPP的耐受性要好于AOB，这可能与二者不同的生理特性有关[22-23]，也与硝化抑制剂的作用机理有关。硝化抑制剂主要通过抑制AOB繁殖来减缓硝化作用[20，24]。通过比较硝化抑制剂DCD和DMPP对AOB数量抑制的程度，可以发现DMPP抑制AOB生长的时间和程度均明显好于DCD。这与DMPP减少N2O排放和NO3-浓度的作用以及延缓NH4+氧化的作用均远远好于DCD的研究结果相吻合。

NO3-经NH4+氧化生成后可通过土壤反硝化过程产生N2O[25]。对于水稻土，生成的较高硝酸盐和淹水条件使得大量N2O通过土壤反硝化作用排放。反硝化过程的限速步骤主要由含nirK或含nirS基因的反硝化细菌参与完成[26]。本研究中，在所有处理中nirK基因拷贝数均显著高于nirS基因拷贝数，说明含nirK基因的反硝化细菌在反硝化作用中贡献可能大于含nirS基因的反硝化细菌。其他研究者在农田和稻田土壤也发现了相似的结果[27-29]。添加DMPP在施肥前期(施肥后第3和30天)显著减少了nirS和nirK基因拷贝数，后期抑制作用有减缓的趋势。而DCD对nirS和nirK基因拷贝数在整个试验期间无明显影响。这种差异可能是由于DCD相对于DMPP对硝化过程有较弱的抑制作用，使得NO3-生成较快，大量的NO3-为含nirK或含nirS基因的反硝化细菌提供了底物，进而使得DCD相对于DMPP对反硝化细菌的抑制效果并不明显[30]。

4 结论

1)硝化抑制剂DCD和DMPP显著抑制氨氧化细菌数量，但对氨氧化古菌没有影响，并且DMPP对氨氧化细菌的抑制效果要好于DCD。

2)施用硝化抑制剂DMPP能显著减少含nirS和nirK基因的反硝化细菌数量，从而延缓NH4+氧化，而DCD对其无明显影响。

3)DMPP减排N2O的效果好于DCD，供试条件下，二者的减排率分别为21.6%和78.3%。