超声引导下FNAB及VEGF、MBL检测在良恶性甲状腺结节鉴别诊断中的应用

史甜甜，杨晓琳，刘阁玲

(唐山市工人医院，河北唐山 063000)

近年来，甲状腺结节呈高发趋势，超声检查检出率为50%～60%[1]，其中恶性结节即甲状腺癌发病率占7%～15%，也呈逐渐增加趋势[2,3]，性质判别成为甲状腺结节的评估要点[4]。超声检查是评估甲状腺结节性质的首选方法，其准确性易受到超声医师的临床技术经验、超声设备及结节自身形态特点等多种因素影响。CT检查对甲状腺癌淋巴结转移具有一定诊断意义，而对甲状腺结节自身性质判别不具优势。细针穿刺抽吸活检(FNAB)因其操作简单、创伤小、患者不适感低、费用少而成为甲状腺结节鉴别诊断的重要检查方法，在国外已成为基本的常规检查。甲状腺FNAB是一种敏感性和特异性均较高的方法，但其也有一定的局限性，有15%～30%的结节性质不能被明确。目前，随着精准医学的发展，分子标志物的研究日趋成熟，血管内皮生长因子(VEGF)、甘露糖结合凝集素(MBL)是甲状腺癌的分子标志物，FNAB联合分子标志物检测的应用很大水平上弥补了FNAB的局限及不足，但FNAB联合VEGF、MBL的价值尚未明确。本研究以择期行手术治疗的甲状腺结节患者68例(80个结节)为研究对象，对比FNAB、VEGF、MBL单独及联合鉴别诊断良恶性结节的效能，以期为临床优选鉴别诊断方法提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017年11月～2018年7月唐山市工人医院、唐山市人民医院、唐山市弘慈医院择期行手术治疗的甲状腺结节患者68例(80个结节)，男17例，女51例；年龄19～62(45.53±9.76)岁。所有患者均符合穿刺指征及知情同意，且无化疗、放疗及免疫治疗病史，均行FNAB以及甲状腺手术治疗。

1.2 FNAB方法 患者排除FNAB禁忌证，术前签署知情同意书。取仰卧位，肩部垫高15°～30°，保持头颈部过伸位，充分暴露甲状腺位置。超声下定位穿刺点，皮肤消毒，铺无菌洞巾，使用5 mL注射器及7号针头(22 G)，超声引导下沿预定针道进入结节中心，负压状态下多点抽吸≥5次，穿刺过程中应保证针尖始终位于结节内部，标本涂片4～5张，95%乙醇固定15 min以上。穿刺结束后嘱患者局部按压10 min后复查超声，观察有无血肿等。将固定好的涂片取其中2张行HE染色，由有经验的病理科医师做出细胞学诊断，细胞学诊断方法按照甲状腺细胞病理学Bethesda分类标准：Ⅰ级标本不满意或无法诊断；Ⅱ级良性病变；Ⅲ级AUS/FLUS即意义不明的细胞非典型性病变或滤泡性病变；Ⅳ级FN/SFN即滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤；Ⅴ级可疑恶性肿瘤；Ⅵ级恶性肿瘤[5]。

1.3 VEGF、MBL检测方法 固定好的另外2～3张涂片行免疫组化染色，具体方法：①蒸馏水洗涤涂片3 min，PBS洗涤3 min×3次；②3%H2O2室温孵育10 min，PBS洗涤3 min×3次；③根据抗体自身属性EDTA修复，PBS洗涤3 min×3次；④滴加一抗，37 ℃温育1 h或4 ℃过夜，PBS洗涤3 min×3次；⑤滴加二抗，室温孵育10～15 min，PBS洗涤3 min×3次；⑥滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育10～15 min，PBS洗涤3 min×3次；⑦DAB显色5～8 min；⑧流水洗涤涂片，苏木素染色；⑨梯度酒精脱水，晾干后封片。VEGF、MBL均为胞质着色，阳性细胞着色为棕黄色或棕褐色，采用半定量积分法评分标准，将染色强度分为3级，无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分；每张涂片选3个视野，显微镜下计数3个视野中阳性细胞数百分数，取3个视野阳性细胞百分比平均值，阳性细胞百分数≤3%为0分，3%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分；上述两项乘积最后得分0分为阴性(-)，1分为弱阳性(+)，2～3分为阳性(++)，4分以上为强阳性(+++)，(+)及以上判定为阳性表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。以手术后组织病理学结果作为甲状腺结节性质判定的金标准，分别计算FNAB、VEGF、MBL单独及联合应用鉴别诊断的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确性，计算ROC曲线下面积，以评估甲状腺结节良恶性的鉴别诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本研究80个结节中，手术病理证实为恶性结节48个，均为甲状腺乳头状癌，其中微小乳头状癌33个、甲状腺乳头状癌结节12个、甲状腺乳头状癌(滤泡亚型)结节3个；良性结节32个，其中结节性甲状腺肿25个、甲状腺腺瘤结节3个、桥本甲状腺炎结节3个、肉芽肿性甲状腺炎结节1个。FNAB、VEGF、MBL、FNAB+MBL、FNAB+VEGF、FNAB+MBL+VEGF诊断为恶性的结节中真阳性的例数分别为38、43、45、44、44、43个，诊断为良性的结节中真阴性的例数分别为29、26、17、25、27、29个。FNAB、VEGF、MBL单独及联合鉴别诊断甲状腺结节的结果见表1。

表1 FNAB、VEGF、MBL单独及联合鉴别诊断甲状腺结节的结果

3 讨论

随着甲状腺结节检出率的增加，排除甲状腺癌成为临床诊治要点，由于大多恶性结节治疗结局良好，而相对“不积极”的治疗仍可获得较好的效果，导致甲状腺结节的诊治思路更趋于保守。目前，甲状腺结节常用检查方法包括实验室血清学检查、超声、CT、MRI、核素扫描、组织细胞学检查等，血清学检查包括甲状腺相关激素、抗体、甲状腺球蛋白等检测，可为结节病因诊断提供更多依据；超声作为评估甲状腺结节的首选方法具有无创、经济、可重复性强等优点，但其鉴别诊断结节良恶性的能力与超声设备、超声医师的临床技术经验和结节自身形态特点等多种因素相关；CT和MRI检查可作为超声检查的补充，对术前患者的病情评估和制定手术方案有一定意义；甲状腺放射性核素扫描可以确定某个结节的功能状态，但其对甲状腺结节良恶性鉴别不具优势，不能作为甲状腺结节诊治的依据。

甲状腺FNAB较单纯超声检查更能筛选出高风险结节，增加了甲状腺手术的选择性，已成为目前甲状腺结节诊治的常规检查。本研究中FNAB鉴别诊断甲状腺结节良恶性的灵敏度为79.17%、特异度为90.63%、准确性为83.75%，与相关研究无明显差异，同时证实甲状腺细胞病理学Bethesda报告系统(TBSRTC)结果是相对可靠的，可用于指导甲状腺结节的诊治[6,7]。近些年来，分子诊断技术发展迅猛，在甲状腺癌的术前良恶性鉴别和预后判断等方面得到广泛应用。甲状腺癌分子标志物的研究主要为FNAB或抽血后获得，目前甲状腺癌的分子标志物主要包括DNA、RNA和蛋白质3类[8]。FNAB联合分子标志物检测提高了甲状腺结节FNAB的准确性，帮助确定更为合理的诊治方案，具有很大的临床应用价值[9,10]。

免疫组化检测因其原理清晰、操作简单、费用较低等在临床诊治中的作用逐渐凸显，成为临床病理诊断中不可缺少的手段[11]。VEGF为甲状腺癌中研究比较成熟的一种分子标志物，在甲状腺癌的生长和转移中具有重要作用，为一种肝素亲和的外分泌二聚体蛋白，是强有力的促血管生成因子，可影响多种免疫抑制细胞的功能，还参与了肿瘤免疫逃逸的发生[12]。VEGF在甲状腺癌中的的表达显著高于正常甲状腺组织，可促进血管生成，推进甲状腺癌的发展，在有淋巴转移的甲状腺癌中较无转移的有更高的表达。本研究中VEGF鉴别诊断的灵敏度为89.58%、特异度为81.25%、准确性为86.25%。MBL为一种血清C型凝集素，由肝脏合成分泌，MBL的生物学功能主要有启动补体系统活化，促进吞噬、免疫调节以及识别糖配体，调节免疫反应等作用[13]。关于MBL与肿瘤相关性的研究，国内外相关文献均较少，如结肠直肠癌[14]、胃癌[15]、卵巢癌[16]、肝癌[17]等几种，我们课题组曾应用mRNA差异显示技术，克隆了手术切除的人甲状腺乳头状癌组织和甲状腺未分化癌组织及其癌旁正常甲状腺组织的差异基因，发现MBL基因在甲状腺未分化癌和乳头状癌中呈现差异表达，提示MBL基因可能与甲状腺癌的发生发展有密切的关系[18]。后我们课题组又进一步研究MBL在甲状腺肿瘤组织中的表达，发现在正常甲状腺组织、甲状腺腺瘤及甲状腺乳头状癌中，MBL表达呈递增趋势，且差异有统计学意义[19]。本研究中MBL鉴别诊断的灵敏度为93.75%、特异度为53.13%、准确性为77.50%。提示MBL鉴别诊断的灵敏度较高，而特异度较低，导致其误诊率较高，不适合用于单独鉴别诊断。

目前，FNAB联合分子鉴别诊断的研究比较多，对甲状腺结节性质判别，2009版ATA指南主要看超声影像和FNA，而新版ATA指南强调了分子鉴别诊断的地位[5]。BRAFV600E基因检测是甲状腺分子标志物中的一大突破，其特异性极高，而灵敏度稍差[20,21]。另外，FNA联合蛋白质标记物Galectin-3、CK-19、HBME-1的诊断能力也得到肯定[22～25]。本研究显示，FNAB联合MBL、VEGF鉴别诊断的灵敏度为89.58%、特异度为90.63%、准确性为90.00%。提示三种方法联合具有较高的鉴别诊断能力，将特异度与准确性提高至90%以上，具有较高的临床诊断价值。遗憾的是本研究只收集到甲状腺乳头状癌的病例，未收集到甲状腺滤泡状癌及其他类型的恶性病变，MBL与VEGF的表达情况未有论断，且本次研究的样本量不大，需进一步对上述研究进行完善。同时相信随着科学研究的不断进步，会有越来越多高效的分子标志物出现在大众视野，为甲状腺结节的诊治带来更有意义的指导。

总之，FNAB联合VEGF、MBL有助于甲状腺结节良恶性的鉴别诊断，可有效指导其进一步临床诊治。