自拟和痹方对人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞炎症因子分泌的影响及其机制探讨

姜萍，邢洁，纪淳望，刘英，马洪美，姜月华

(1山东中医药大学第一临床医学院，济南 250014；2山东中医药大学中医学院；3南昌大学医学部；4山东中医药大学附属医院；5滕州市中医院)

类风湿关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎症为基本病理表现的系统性自身免疫病。近年大量研究显示，RA成纤维样滑膜细胞(FLS)的过度增殖及炎症因子的产生是RA发生发展和转移的关键。胆碱能抗炎通路(CAP)是一条链接于神经系统与免疫系统之间的抗炎通路[1]，国内已有研究证实通过CAP可抑制FLS炎症因子的分泌，减轻RA的炎症反应[2]。但国内、外尚无相应的治疗RA干预药物。我们前期研究证实，和痹方不仅能有效缓解RA患者的关节肿痛，改善实验室指标、滑膜厚度等，而且能够缓解神疲乏力、精神萎靡等与迷走神经相关的全身症状[3,4]。本研究观察了和痹方对RA中FLS炎症因子分泌的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物、试剂及仪器 Wistar大鼠60只，8周龄，雌雄各半，体质量(150±20)g，SPF级，均购自山东大学医学院动物实验中心[合格证号为SCXK(鲁)20160007]，购进大鼠后供给充足的水和饲料，预饲养7 d。和痹方(当归20 g、白芍30 g、白术15 g、苍术15 g、川芎20 g、防风9 g、青风藤20 g、肿节风30 g、生甘草6 g)由山东中医药大学附属医院制剂室提供，每毫升含生药1 g的溶液，经高温消毒封瓶，4 ℃冰箱保存备用；甲氨蝶呤片(MTX，2.5 mg/片，上海医药集团有限公司信谊制药总厂)。PNU-282987(P6499，购于美国Sigma公司)，高迁移率组蛋白1(HMGB1)ELISA法试剂盒(HM10235)、白介素(IL)-17 ELISA法试剂盒(HM10198)均购于Bio Swamp公司，α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)兔单克隆抗体(ab76315,Abcam公司)，核转录因子-κB亚基p65(NF-κB p65)兔多克隆抗体(10745-1-ap)、山羊抗兔二抗(SA00001-2)均购于Proteintech公司。全波长酶标仪(Thermo Fisher 1510)，洗板机(FCC Compliance 76883)，消毒箱(热空气sut6120)，酶标仪(BIO-RAD iMARK)，电泳仪(BIO-RAD Power pac)，显影仪(SAGECREATION Minichemi 420-k4)，超声仪(南京先欧 XO-1000D变幅杆Ф3)。

1.2 和痹方药物血清制备 将60只大鼠分为模型组、激动剂组、MTX组、低剂量组、中剂量组、高剂量组各10只。激动剂组：PNU-282987采用IEq盐酸溶解后再次应用生理盐水稀释，按0.38 mg/kg[5]进行腹腔注射，每天注射1次；MTX组：MTX灌胃，剂量为0.7 mg/kg[6]，每周1次；低剂量组：中药灌胃，3 g/kg，1次/d；中剂量组：中药灌胃，6 g/kg，1次/d；高剂量组：中药灌胃，12 g/kg，1次/d；模型组：生理盐水适量灌胃。灌胃持续14 d，末次灌胃3 h后下腔静脉取血，静置后离心，56 ℃灭活，抽滤除菌，分装，-20 ℃保存备用。

1.3 滑膜组织获取及FLS分离、培养、鉴定 滑膜组织取材于山东中医药大学附属医院、山东省千佛山医院、滕州市中医院行膝关节置换术的RA患者(患者男1例、女5例，年龄55～69岁、平均62岁，病程8～20 a，平均14.33 a)。取材前征得患者的知情同意，并签署知情同意书。RA诊断符合美国风湿病协会(ACR)2010年修订的诊断标准。本研究经滕州市中医院伦理委员会批准(批准号：2018001)。根据文献[7]，采用消化酶培养法进行FLS培养、传代。将FSL加入放入盖玻片的6孔板培养72 h，对细胞贴片进行HE染色和细胞免疫组化按试剂盒操作，鼠抗人波形蛋白(vinlentin)单抗、FⅧ因子单抗、CD68单抗(均为1∶1 00稀释)三染进行鉴定，以非免疫鼠IgG作为阴性对照。HE染色：细胞长梭状极向排列，分裂相少见。免疫组化：滑膜巨噬样细胞的标记CD68(-)、新生血管内皮细胞的标记FⅧ因子(-)、成纤维样细胞的表面标记vinlentin +，符合人关节FSL特点。

1.4 FLS分组及和痹方药物血清干预 将FLS移至6孔板中培养，随机分为模型组、激动剂组、MTX组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。激动剂组每孔加入含10%PNU-282987药物血清的DMEM培养液；MTX组每孔加入含10% MTX药物血清的DMEM培养液；低剂量组每孔加入含10%低剂量和痹方药物血清的DMEM培养液；中剂量组每孔加入含10%中剂量和痹方药物血清的DMEM培养液；高剂量组每孔加入含10%高剂量和痹方药物血清的DMEM培养液；模型组每孔加入10%DMEM血清的培养液。24 h后取细胞上清液及滑膜细胞。

1.5 FLS上清液中IL-17、HMGB1检测 按照ELISA试剂盒说明书检测细胞上清液中IL-17、HMGB1。先加入标准品和待测样品，设置阴性对照，用封板膜封板后置入37 ℃温育30 min，揭去封膜，弃去液体，甩干，加洗涤液重复洗板5次。加入酶标试剂，再次置37 ℃温育30 min，洗板5次，加显色液A、B各50 μL，37 ℃避光显色15 min，加入终止液终止反应，于450 nm波长酶标仪检测吸光度(OD值)。

1.6 滑膜细胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白检测 采用Western blotting法。具体操作参照文献[8]，结果以灰度值表示。

1.7 滑膜细胞中α7nAChR mRNA检测 采用RT-PCR法。按常规方法取得提取滑膜组织中总mRNA，进行逆转录、反转录反应，合成引物：5′-CAAGGCGAGTTCCAGAGGAG-3′，5′-GGGAGAAGTACACGGTGAGC-3′，扩增条件：95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45个循环。将模型组mRNA的表达处理为标准，作为“1”，其他数值为检验值。具体公式如下：各组检验值=2-(待测周期均值该组内参周期均值)-(模型组待测周期均值-模型组内参周期均值)。

2 结果

2.1 各组细胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比较 结果见表1。

表1 各组细胞上清液中IL-17、HMGB1的OD值比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与激动剂组比较，#P<0.05；与MTX组比较，ΔP<0.05。

2.2 各组细胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比较 结果见表2。

表2 各组细胞中α7nAChR、NF-kBp65蛋白及α7nAChR mRNA比较

注：与模型组比较，*P<0.05；与激动剂组比较，#P<0.05；与MTX组比较，ΔP<0.05；与低剂量组比较，□P<0.05；与中剂量组比较，▲P<0.05。

3 讨论

RA是—种以对称性多关节炎为主要临床表现的自身免疫性疾病，以关节滑膜慢性炎症、关节的进行性破坏为特征。FLS是RA炎性滑膜组织中的主要细胞成分，可向关节软骨表面迁移和侵袭，导致关节软骨及骨的侵蚀，最终引起关节破坏，在RA的发生发展过程中发挥重要作用[9,10]。

和痹方是临床治疗RA的经验方剂，方中当归、白术、苍术、白芍疏肝健脾、活血理气，青风藤、肿节风、防风、川芎祛风除湿、行气活血、调通经络，甘草调和诸药。现代药理研究发现，白芍的有效成分白芍总苷具有抗炎镇痛、调节免疫的作用，能够抑制滑膜细胞的过度增殖，降低IL-1、前列腺素E2等炎症因子水平[11]；此外，白芍还具有保肝作用，减轻药物的不良反应。青藤碱能够抑制NF-κB活化，降低炎症因子水平[12]，肿节风具有调整机体免疫、抗炎镇痛的作用，可降低肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1等炎症因子水平。防风与川芎也具有增强免疫力、消炎镇痛的作用。前期研究结果显示，和痹方能够有效缓解RA患者的临床症状及实验室指标，减轻RA大鼠(CIA)的关节红肿疼痛，降低CIA血清中IL-6、HMGB1等炎症因子水平，减轻CIA关节软骨的破坏[3,4,13,14]。

有研究发现，RA患者血清和关节滑液中IL-17水平均升高，并与RA疾病的严重程度相关[15]。IL-17是T细胞源性促炎因子，在RA发病早期即可通过上调诱导型氧化亚氮合酶促进关节软骨细胞释放一氧化氮，诱导基质金属蛋白酶-1,3,13、环氧化酶-2、IL-6、基质降解酶以及IL-1的表达，参与骨侵蚀，促进慢性炎症的发生[16]。同时，IL-17可以和TNF-α、γ-干扰素、IL-1β等细胞因子相互作用，产生协同效应。HMGB1可促使NF-κB及丝裂原活化蛋白激酶的激活，刺激单核细胞产生TNF-α、IL-1、IL-6及巨噬细胞炎症蛋白，并激活吞噬细胞，诱导多种黏附分子的表达，是一种作用广泛的促炎因子。已有研究证实，HMGB1的表达与ESR、CRP、关节压痛数、关节肿胀数呈正相关，可作为评价RA病情活动的指标之一[17]。本实验显示，中剂量组、MTX组均可显著降低IL-17、HMGB1水平，且中剂量组IL-17降低水平不及MTX组，两组之间的HMGB1水平无统计学差异。结果表明中剂量和痹方与MTX更能有效的抑制研制因子IL-17与HMGB1表达。

CPA是新近研究发现的存在于中枢神经系统与免疫系统之间一条具有拮抗炎症反应作用的通路。该通路由迷走神经及其递质乙酰胆碱(Ach)所构成，Ach与免疫细胞表面的α7nAChR结合后通过调节下游NF-κB信号通路，抑制促炎因子的转录和合成，发挥抗炎作用。α7nAChR是CAP发挥作用的关键受体，胆碱能激动剂激活α7nAChR后，可抑制NF-κB p65的核转移，从而抑制炎症因子的生成。已有实验证明，FLS表面存在α7nAChR的表达[2]，通过上调α7nAChR的表达可抑制FLS分泌炎症因子。但目前尚无理想药物能够上调α7nAChR的表达。本实验发现激动剂组、中剂量组可上调α7nAChR蛋白表达多，减少NF-kBp65蛋白表达；MTX组可降低NF-kBp65蛋白表达；激动剂组、中剂量组可促进α7nAChR mRNA的表达。表明中等浓度的和痹方具有上调α7nAChR mRNA与蛋白表达的作用，从而抑制NF-kB信号通路，降低炎症因子IL-17、HMGB1等炎症因子水平。

总之，复杂的细胞因子网络是RA发生、发展的重要机制，和痹方剂能够激活CAP，上调α7nAChR的表达，通过抑制上游的信号通路，从而降低下游炎症因子水平，减轻关节破坏，为RA的治疗开辟新的思路。