EGCG对β-胡萝卜素乳液物理稳定性的影响

刘 蕾 陈历水 马 莺 高彦祥

(1.中粮营养健康研究院有限公司品牌食品研发中心， 北京 102209； 2.哈尔滨工业大学化工与化学学院， 哈尔滨 150090；3.中国农业大学食品科学与营养工程学院， 北京 100083)

0 引言

β-胡萝卜素是一种脂溶性类胡萝卜素，具有合成维生素A、猝灭单线态氧和使自由基失活等多种生物学功能。但由于β-胡萝卜素在水中的溶解度低，熔点高，在光和热的环境中容易发生化学降解等性质限制了其在食品工业中的应用。利用水包油的乳液传递β-胡萝卜素是一种成本较低，可以提高其水溶性、稳定性及生物利用率的方法[1-2]。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是茶叶茶多酚中含量最高同时抗氧化活性最强的物质。乳蛋白和茶多酚可以多种方式进行相互作用，形成的复合物对乳液的物理及化学稳定性都有一定的影响。RASHIDINEJAD等[3]研究了EGCG对牛奶脂肪球稳定性的影响，实验中利用离心的方法将牛奶的脂肪球从牛奶中分离出来后溶解在缓冲溶液中，利用相同的缓冲溶液将EGCG加入只含有脂肪球的乳液中，EGCG显著改变了乳脂肪球的粒径和zeta-电位；并利用透射电镜和傅里叶红外光谱研究了EGCG和乳脂肪球膜的相互作用，结果表明，EGCG可以与乳脂肪球膜的疏水区和亲水区相互作用。DI MATTIA等[4]将茶多酚加入以β-乳球蛋白和吐温20为复合乳化剂的乳液中，结果表明，茶多酚可以结合到油水界面上，茶多酚添加量越多，界面张力越小，茶多酚使油滴粒径变大但并没有影响乳液中的油脂氧化。

本文在不同pH值的β-胡萝卜素乳液中添加不同含量的EGCG，测定EGCG对乳液物理稳定性(粒径、电位、包埋率和快速稳定性)的影响。为研究EGCG对乳液稳定性的影响机理，同时测定界面蛋白含量、α-乳白蛋白(α-LA)与EGCG混合溶液的浊度变化和热力学参数指标，以期为EGCG作为抗氧化剂添加到β-胡萝卜素乳液中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-LA，购于美国Davisco公司，纯度95%以上；EGCG，购于北京北实纵横科技发展有限公司，纯度99.5%以上；中链三酸甘油酯(Medium chain triacylglycerol, MCT)，购于奎斯特国际有限公司；30% β-胡萝卜素-MCT 悬浮液，购于浙江医药有限公司新昌制药厂；柠檬酸、磷酸氢二钠、正己烷、碳酸钠、磷酸、无水乙醇，购于北京化工厂，纯度99.5%以上；考马斯亮蓝试剂、叠氮化钠，购于美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

M-110型高压微射流均质机，美国Microfluidizer公司；Zatasizer Nano-ZS90型激光粒度仪，英国马尔文公司；HD-1型高速乳化均质机，北京华远航实验设备厂；UV-1800型紫外-可见分光光度计，日本岛津公司；TurbiscanLab Expert 浓缩体系稳定性分析仪，法国Formulaction 公司；RC2-S型超高速离心机，美国Sorvall 仪器公司；S22-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；2100N型浊度计，美国HACH公司；Nano型等温滴定量热仪，美国TA公司。

1.3 方法

1.3.1β-胡萝卜素乳液制备

将质量分数1.5%的α-LA溶解于0.1 mol/L pH值2.0或pH值7.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，在室温(20℃)下搅拌4 h至α-LA全部溶解，待用。将30%的β-胡萝卜素-MCT悬浮液加热溶解于MCT中至其完全溶解待用，溶解方法参照XU等[5]的方法，并做了一定的调整。

在高速剪切仪的搅拌下将溶解有β-胡萝卜素的MCT缓慢加入α-LA溶液中，12 000 r/min剪切10 min，形成粗乳液。将制备的粗乳液进一步通过微射流(82.7 MPa)均质，循环3次[6]。由此制备的β-胡萝卜素乳液(10%油相(含有0.5%β-胡萝卜素)，1.5% α-LA)用于后续实验。

取制备好的β-胡萝卜素乳液与不同浓度的EGCG缓冲溶液等质量混合。乳液中各组分的最终质量分数为：MCT 5%(其中含有0.5%β-胡萝卜素)，α-LA 0.75%。pH值2.0乳液中EGCG添加量：0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%、0.200 0%、0.400 0%、0.500 0%；pH值7.0乳液中EGCG添加量：0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%。

1.3.2乳液粒径和电位测定

测定β-胡萝卜素乳液粒径分布(Polydispersity index,PDI)、z-平均粒径和zeta-电位，基于动态光散射原理进行粒径和电位分析。在粒径和电位测定之前，利用与制备β-胡萝卜素乳液相同的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值2.0和pH值7.0)将乳液稀释，以避免由于液滴浓度过大而引起的多重散射效应影响测定结果。在最终的测定溶液中乳液液滴质量分数应小于0.005%[7]。

1.3.3乳液包埋率测定

β-胡萝卜素乳液包埋率测定方法参照SURH等[8]的方法并进行一些调整。在1.0 mL的乳液中加入3.0 mL的正己烷，振荡30 s。混合均匀后在离心力10 000g条件下离心5 min。取上清液于10 mL容量瓶中用正己烷定容。在450 nm下测定β-胡萝卜素的吸光度。根据标准曲线计算出β-胡萝卜素的含量。由此测出的含量即为未被包埋的β-胡萝卜素的含量。包埋率计算公式为

式中A——包埋率，%

C1——未被包埋的β-胡萝卜素质量浓度，mg/mL

C0——β-胡萝卜素质量浓度，mg/mL

1.3.4乳液快速稳定性测定

本实验对β-胡萝卜素乳液的快速稳定性进行了分析。Turbiscanlab Expert浓缩体系稳定性分析仪采用脉冲近红外光源(波长λ=880 nm)自下而上扫描样品，两个同步光学探测器分别搜集透射光(Transmission，TM)和背散射光(Backscattering，BS)。在一定时间内连续对样品进行扫描，即可获得透射光和背散射光信号对样品高度的函数曲线图。每次扫描产生一条扫描曲线，在扫描时间内对不同扫描曲线进行比较分析即可反映样品中颗粒的运动趋势，进而预测出乳液的稳定性[9]。

β-胡萝卜素乳液的样品浊度高，透射光强度小。根据仪器规定，在样品透光率小于0.2%时，即采用背散射光数据对样品进行分析。在测定中，β-胡萝卜素乳液的透光率小于0.1%，因此本实验中采用背散射光的变化进行样品稳定性分析。因为影响扫描曲线的因素除了乳液自身因素之外还有环境因素，因此，不同样品的背散射光曲线没有可比性。在分析比较不同样品的稳定性时，通常采用背散射光强变化值(ΔBS值)。ΔBS值排除了系统误差对样品扫描曲线的影响，因此比较在相同扫描时间内不同样品ΔBS值可以对乳液的稳定性进行预测[10]。

1.3.5乳液界面α-LA含量测定

为了测定界面蛋白含量，通过超高速离心法将乳液中游离相α-LA与界面α-LA分离，参照FARAJI等[11]的方法。将乳液置于10 mL的超高速离心管中，在超高速离心机中离心50 min，离心力为36 000g。为避免β-胡萝卜素在离心过程中发生氧化，将离心机温度设定在10℃。离心结束后，利用带有长针头的注射器小心分离下层清液和上层乳析层。

取一定体积的下清液通过0.1 μm聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜进行过滤，去掉较大液滴乳析层颗粒[12]。取一定量过滤后的下层清液，利用考马斯亮蓝法测定下清液中蛋白含量[13]。

1.3.6溶液制备

α-LA溶液：将1.5%α-LA溶解在0.1 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值7.0)中，室温下搅拌4 h，使α-LA完全溶解，待用。

EGCG溶液：将1.0%EGCG溶解在0.1 mmol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液(pH值7.0)中，超声处理2 min，并在室温下搅拌10 min，使EGCG完全溶解。室温下，EGCG在pH值7.0的缓冲溶液中容易发生氧化，因此EGCG溶液现用现配。将1.0%的EGCG溶液进行不同倍数的稀释得到不同浓度的EGCG溶液用于后续实验。

α-LA与EGCG混合溶液：将1.5%的α-LA溶液与等质量的不同浓度的EGCG溶液混合，混合溶液中α-LA质量分数为0.75%，EGCG质量分数为0、0.002 5%、0.005 0%、0.010 0%、0.020 0%、0.050 0%、0.100 0%、0.200 0%、0.400 0%、0.500 0%。溶液混合1 h后，进行粒径和浊度的测定[14]。

1.3.7溶液浊度测定

利用浊度仪测定α-LA与EGCG混合溶液的浊度。浊度仪的光学系统包括一套(870±30) nm光发射二极管(LED)装置、一个90°散射光检测器和一个LED检测器。测量过程中，由光源发出平行的光束通过溶液，其中一部分光被吸收和散射，另一部分透过溶液。利用90°散射光检测器进行散射光检测。入射光恒定的条件下，在一定浊度范围内，散射光强度与溶液的浑浊度成正比，测量时选择散射光浊度单位(Nephelometric turbility units, NTU)模式，测量温度为25℃。

1.3.8α-LA与EGCG相互作用程度测定

等温滴定量热技术(Isothermal titration calorimetry,ITC)是一种利用反应热量变化表征反应进行程度的技术。测定反应过程中热量的变化，建立反应物质总体的浓度变化与反应热量变化之间的函数，并结合一定的数学模型，计算热力学参数。微量热等温滴定技术具有灵敏度高、实时在线的特点，并且测量仪器具有差热功率补偿系统，可快速平衡热量以便连续滴定。通过ITC实验，可同时获得多个热力学参数，如吉布斯自由能变化量ΔG、反应焓变ΔH、反应熵变ΔS及结合常数K。

本实验中应用ITC测定EGCG与α-LA在连续滴定过程中的热量变化。实验在25℃条件下进行。在进行实验之前，将EGCG溶液和α-LA溶液进行过滤(0.45 mm水系膜)，过滤完成后进行真空脱气。取脱气完全的α-LA溶液300 μL注入样品池中，50 μL的EGCG溶液置于注射器中。在滴定之前，先将仪器平衡3 600 s。待仪器平衡后，300 s后开始滴定，在滴定过程中，设置温度为25℃，注射器搅拌速率为300 r/min，反应时间间隔为300 s。每滴滴定液的体积为2.0 μL，连续滴定25滴。对照实验是将同样浓度的EGCG溶液滴定到只含有缓冲溶液的样品池中，将样品的滴定曲线减去对照实验的滴定曲线即为样品实际热量变化曲线。根据样品的热力学曲线，选择合适的结合模型进行在线模拟，计算得到热力学参数。

1.4 数据分析

在所有实验中，每个样品设置3个平行样品，并根据实验结果计算平均值和标准差。实验中使用GraphPad Prism 5 (美国GraphPad Software 公司)软件，利用ANOVA方差分析和Turkey检验进行分析。

2 结果与分析

2.1 β-胡萝卜素乳液粒径和电位

pH值是影响EGCG发挥抗氧化或促氧化作用的因素。 酸性环境增强了金属离子的溶解性和稳定性，使金属离子可催化更多的氧化反应。随着pH值的提高，EGCG的抗氧化活性增强，但金属离子由于溶解度问题，其催化的氧化反应减少[15]。为了研究EGCG在β-胡萝卜素乳液中发挥抗氧化/促氧化作用，制备了pH值2.0和pH值7.0的β-胡萝卜素乳液，研究不同pH值和EGCG添加量对β-胡萝卜素乳液粒径(z-平均粒径)和电位(zeta-电位)的影响，实验结果如表1所示。由于在pH值7.0的乳液中，当EGCG添加量大于0.1%时，乳液快速分层，无法得到稳定的β-胡萝卜素乳液，因此没有进行粒径和电位的测定。

由表1可以得出，在pH值2.0的乳液中，EGCG的加入对β-胡萝卜素乳液的粒径没有显著影响(p>0.05)。SABOURI等[16]报道了将不同含量的EGCG(质量分数0.05%～0.90%)添加到以酪蛋白为乳化剂的乳液中，EGCG添加量对乳液粒径没有显著性影响。这与本实验结果相同。在pH值7.0的乳液中添加不同含量的EGCG使乳液粒径有显著减小趋势。EGCG的加入使α-LA的团聚状态解离，使其更容易吸附到水油界面上，形成较小的液滴[17]，因此，本实验中EGCG的加入使乳液粒径减小可能是因为α-LA在团聚状态时形成的乳液粒径比较大，加入EGCG后使α-LA的团聚状态解离，使其更容易吸附到水油界面上，形成了粒径较小的液滴。不同pH值乳液中，β-胡萝卜素乳液的粒径有显著性差异。其中pH值7.0的乳液粒径显著大于pH值2.0乳液的粒径。这可能是因为α-LA在pH值2.0时，发生部分变性，形成熔球状构型。相比在中性环境中的α-LA，pH值2.0的α-LA分子失去三级结构，结构变得更加松散，表面疏水性增加。这会使其表面活性增加，快速吸附到油滴界面上，在通过微射流的过程中，形成较小的液滴。

在pH值2.0和pH值7.0的乳液中，EGCG的加入没有显著影响β-胡萝卜素乳液的电位(p>0.05)，此结果与SABOURI等[16]的结果相同。这主要是因为EGCG是不带电荷的小分子物质，因其自身不带电荷，不会影响界面电位。有文献报道EGCG可以通过疏水相互作用和氢键与乳蛋白相互作用[18-19]。但由于EGCG不带电荷，在一定添加量的范围内，不能改变乳液的电位。在不同pH值条件下，β-胡萝卜素乳液的电位有显著性差异(p<0.05)。在pH值2.0时，乳液电位大于40 mV，而pH值7.0的乳液中，电位在-15 mV左右。这主要是因为α-LA的等电点pI值在4.0～5.0之间[17]，当乳液pH值为2.0时，低于其pI值，α-LA带正电，同时因为蛋白变性使得更多的电荷暴露出来，使电位较高；当乳液pH值为7.0时，高于其pI值，α-LA带负电荷，使乳液电位为负值。

表1 EGCG添加量对不同pH值β-胡萝卜素乳液粒径和电位的影响Tab.1 Influence of EGCG on particle size and zeta-potential of β-carotene emulsions at different pH values

注：同列不同字母表示差异显著(p<0.05)。

2.2 β-胡萝卜素乳液包埋率

乳液中β-胡萝卜素的包埋率影响其生物利用率和贮藏稳定性，因此在本实验中测定不同EGCG添加量对β-胡萝卜素乳液包埋率的影响，结果如图1所示，图中相同小写、大写字母分别表示pH值7.0、pH值2.0时没有显著性差异。

图1 EGCG添加量对不同pH值β-胡萝卜素乳液包埋率的影响Fig.1 Influence of EGCG on encapsulation rate of β-carotene emulsions at different pH values

从图1中可得，在pH值2.0和pH值7.0的β-胡萝卜素乳液中，不同添加量的EGCG对β-胡萝卜素的包埋率没有显著影响。茶多酚因分子内含有多个苯环，具有一定的疏水性，而茶多酚分子中大量的羟基使其具有良好的水溶性[17]，因此，茶多酚可以结合到水油界面上，对α-LA有竞争性吸附或替代性吸附作用，进而影响β-胡萝卜素乳液的包埋率。刘蕾等[20]报道了以α-LA为乳化剂的β-胡萝卜素乳液中，α-LA的添加量为0.25%～3.00%时，单位界面面积上α-LA的质量为3.1～5.5 mg/m2，因此，在乳液的水油界面上α-LA 发生了多层吸附。本研究中α-LA的添加量为0.75%时，在β-胡萝卜素乳液的界面上，α-LA发生了多层吸附，EGCG可能与界面上多层蛋白的外层α-LA相互作用，并没有与内层界面蛋白发生竞争性吸附或替代性吸附。因此，EGCG的加入没有影响乳液的包埋率。pH值2.0和pH值7.0乳液的包埋率之间没有显著性差异，进一步说明α-LA已经完全覆盖油滴界面，因此两者包埋率之间没有显著差异。

2.3 β-胡萝卜素乳液快速稳定性

利用Turbiscan Lab Expert浓缩体系稳定性分析仪进行乳液快速稳定性分析，是在一定时间内对乳液进行多次扫描，得到乳液的背散射光扫描曲线，根据扫描曲线的变化进行乳液的快速稳定性分析。对pH值2.0乳液的扫描曲线分析可得，乳液中部的背散射光值(BS值)随着扫描时间的延长逐渐增大，而乳液下部和上部的BS值没有明显变化。因此，对于pH值2.0的β-胡萝卜素乳液，其在贮藏过程中乳液液滴发生絮凝或聚集现象，使乳液粒径增大，当乳液粒径增大到一定程度时会发生分层现象，引起乳液失稳[21-22]。

由于pH值2.0的β-胡萝卜素乳液的失稳机理是乳液液滴发生团聚，因此，分析ΔBS值时选择乳液中部背散射光变化值。不同EGCG添加量的pH值2.0的β-胡萝卜素乳液在扫描过程中ΔBS值随扫描时间的变化如图2所示。从图2可以得出，pH值2.0的β-胡萝卜素乳液在55℃的扫描过程中，ΔBS值呈增大趋势，这说明乳液中液滴的团聚速率逐渐增大，即乳液的物理稳定性变差。当EGCG添加量小于0.2%时，乳液的ΔBS值与未添加EGCG乳液的ΔBS值没有显著性差异；当EGCG添加量大于0.2%时，乳液ΔBS值显著大于未添加EGCG乳液的ΔBS值，表明当EGCG添加量大于0.2%时，乳液的物理稳定性受EGCG添加的影响呈降低趋势。

图2 EGCG添加量对pH值2.0的β-胡萝卜素乳液扫描过程中ΔBS值的影响Fig.2 Influence of EGCG on ΔBS of β-carotene emulsions during scan procedure at pH value of 2.0

对pH值7.0的乳液进行扫描，乳液下部的BS值减小同时上部的BS值增加，中部的BS值没有明显变化。这主要是因为乳液发生了乳析现象即油滴上浮现象。当乳液发生乳析现象时，液滴的上浮导致乳液上部的背散射光值增大，同时引起乳液下部出现澄清，因此，乳液下部的背散射光值减小，更多的光可以通过样品而不发生散射。

由于pH值7.0的乳液在贮藏过程中易发生乳析，所以乳液上部的ΔBS值的变化比较大，可以代表乳液的不稳定现象。因此，在分析pH值7.0的β-胡萝卜素乳液的ΔBS值时选择乳液上部的背散射光变化值。pH值7.0的β-胡萝卜素乳液ΔBS值随扫描时间的变化如图3所示。从图中可以得出，在55℃的扫描过程中乳液的ΔBS值逐渐增大，这说明乳液的油滴上浮速率逐渐增大。同时当EGCG添加量为0.002 5%～0.020 0%时，添加了EGCG的β-胡萝卜素乳液比未添加EGCG乳液的ΔBS值小；在此添加量范围内，随着EGCG添加量的增加，ΔBS值逐渐增大，这说明虽然EGCG的添加使β-胡萝卜素乳液的物理稳定性提高，但随着EGCG添加量的增加，乳液物理稳定性仍呈下降趋势；当EGCG添加量为0.05%和0.10%时，添加了EGCG的乳液的ΔBS值比未添加EGCG的乳液的ΔBS值大。这说明当有大量EGCG添加到β-胡萝卜素乳液中时会使乳液的物理稳定性显著变差。

图3 EGCG添加量对pH值7.0的β-胡萝卜素乳液扫描过程中ΔBS值的影响Fig.3 Influence of EGCG on ΔBS of β-carotene emulsions during scan procedure at pH value of 7.0

从以上结果中可以得出，将EGCG添加到pH值2.0和pH值7.0的β-胡萝卜素乳液中，对乳液稳定性的影响不同。当将EGCG添加到pH值2.0的β-胡萝卜素乳液中时，当添加量大于0.2%时，会引起乳液稳定性的显著性下降；而将EGCG添加到pH值7.0的β-胡萝卜素乳液中时，当添加量为0.002 5%～0.020 0%时，EGCG的添加使β-胡萝卜素乳液的物理稳定性提高，当EGCG添加量大于0.02%时，EGCG的添加使β-胡萝卜素乳液的物理稳定性下降。

为了比较在相同EGCG添加量时不同pH值乳液的稳定性，计算了不同pH值乳液的TSI(Turbiscan稳定性指数)值，结果如表2所示。从表中可得，pH值7.0的β-胡萝卜素乳液的TSI值显著高于pH值2.0的β-胡萝卜素乳液的TSI值，说明在乳液中添加相同含量的EGCG时，pH值2.0的乳液的稳定性高于pH值7.0的乳液。这可能是因为pH值2.0的乳液中α-LA变性，乳化性质提高，致使制备乳液的物理稳定性提高[17]。

表2 pH值2.0和pH值7.0的β-胡萝卜素乳液在扫描过程中TSI值比较Tab.2 Comparison of Turbiscan stability index (TSI) of β-carotene emulsions at different pH values

注：不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

2.4 β-胡萝卜素乳液界面α-LA含量

利用超高速离心法，将乳液中β-胡萝卜素油滴和连续水相分开，由于水相中既含有α-LA同时又含有EGCG，为了在测定α-LA时不受EGCG的干扰，选择考马斯亮蓝法测定水相中α-LA含量。利用总的α-LA添加量减去水相中α-LA含量即可得到界面α-LA含量。

界面α-LA含量如图4所示。在pH值2.0的乳液中，当EGCG添加量小于0.1%时，EGCG的添加量对界面α-LA含量没有显著影响(p>0.05)。当EGCG添加量大于0.1%时，随着EGCG添加量的增加，界面α-LA含量呈下降的趋势(p<0.05)。这可能是因为虽然在利用考马斯亮蓝法测定蛋白含量时不受多酚的影响，但当EGCG添加量比较高时(大于0.1%)，测定结果可能会受到EGCG含量的影响。因此当EGCG添加量高于0.1%时，界面α-LA含量逐渐减少可能是由EGCG干扰所致。在pH值7.0的乳液中，随着EGCG添加量的增加，界面α-LA含量逐渐降低，这可能与EGCG干扰有关。

图4 β-胡萝卜素乳液中EGCG添加量对界面α-LA含量的影响Fig.4 Influence of EGCG on interfacial α-LA concentration of β-carotene emulsions at different pH values

比较pH值7.0和pH值2.0的界面α-LA含量可以得出，pH值7.0乳液中，界面α-LA含量显著高于pH值2.0乳液体系中的界面α-LA含量，其中pH值2.0乳液中，界面α-LA质量浓度为0.94～1.94 mg/mL；pH值7.0乳液体系中，界面α-LA质量浓度为1.81～2.22 mg/mL。这可能是因为虽然pH值2.0体系中α-LA的表面疏水性比pH值7.0的α-LA大，但pH值2.0体系中电位是pH值7.0体系中电位的3倍左右，使得α-LA结合到界面上的阻力增加，由于电位的阻力可能大于表面疏水性的作用，使得pH值2.0体系中界面α-LA含量小于pH值7.0体系的界面α-LA含量[23-24]。

2.5 α-LA溶液粒径

将EGCG作为抗氧化剂添加到pH值7.0以α-LA为乳化剂的β-胡萝卜素乳液中时，当EGCG添加量大于0.1%时，乳液快速分层，不能得到稳定的乳液。为了研究pH值7.0的β-胡萝卜素乳液中添加大量EGCG导致乳液稳定性急剧下降的机理，将研究体系简化，研究了在α-LA溶液中添加不同含量的EGCG对α-LA性质的影响。

在溶液中添加不同含量的EGCG对α-LA粒径的影响如图5所示。从图5a可以看出，当EGCG添加量为0.002 5%～0.050 0%时，随着EGCG添加量的增加，α-LA粒径没有显著性变化(p>0.05)；但与未添加EGCG的α-LA溶液粒径相比，添加了EGCG的溶液的粒径比未添加EGCG的α-LA粒径小(p<0.05)。这可能是因为在溶液中，α-LA呈团聚状态，当少量EGCG加入之后，会使α-LA的团聚解离，使粒径降低。此结果与前面加入EGCG后使乳液粒径减小相一致。

图5 pH值7.0条件下不同EGCG添加量对α-LA溶液粒径的影响Fig.5 Influence of EGCG on particle size of α-LA in solutions at pH value of 7.0

当EGCG添加量大于0.05%时，α-LA的粒径先增大后减小，并显著高于未添加EGCG和添加较少的EGCG溶液(0.002 5%～0.050 0%)的粒径(p>0.05)(图5b)。这主要是因为当EGCG添加量为0.1%时，溶液中颗粒粒径增大，使溶液呈现浑浊的状态，但并没有引起快速的沉淀；当EGCG添加量继续增大时，即添加量为0.2%～0.5%时，EGCG的加入使溶液快速产生沉淀。当测定产生沉淀的溶液粒径时，测定的是上清液的粒径，从而得到的溶液粒径减小。

SHPIGELMAN等[26]报道了将EGCG加入β-乳球蛋白溶液中，随着EGCG添加量的增加，两者形成了粒径较大的复合物，溶液发生浑浊；STASZEWSKI等[26]报道了茶多酚与β-乳球蛋白和酪蛋白肽的相互作用，研究了不同pH值和茶多酚添加量对复合物粒径、电位和结构的影响。结果表明，在β-乳球蛋白在pH值4.5时与茶多酚形成了粒径较大的复合物，而酪蛋白肽在pH值3.0时与茶多酚形成了粒径较大的复合物。

在本实验中，当EGCG添加量大于0.1%时，溶液粒径增大，说明EGCG与α-LA发生了相互作用，形成了粒径较大的复合物。当复合物粒径继续增大时，溶液产生沉淀。

2.6 α-LA溶液浊度

粒径作为衡量溶液中颗粒大小的指标，可以表征EGCG的添加对α-LA粒径的改变，或EGCG与α-LA形成复合物的粒径[26]。浊度作为衡量溶液浑浊程度的指标，是一个宏观的指标，不仅与溶液中不溶解物质的浓度有关系，还与不溶解物质的粒径大小、形状和折射指数有关[27]。

EGCG添加量对α-LA溶液浊度的影响如图6所示。从图中可得，随着EGCG添加量的增加(0.002 5%～0.050 0%)，EGCG和α-LA的混合溶液的浊度逐渐增大。当EGCG添加量大于0.050 0%时，溶液浊度超过了浊度计的量程，说明在溶液中已经形成了较大的颗粒。随着EGCG添加量的增加，溶液的浊度逐渐增大，并产生沉淀。

图6 pH值7.0条件下不同EGCG添加量对α-LA溶液浊度的影响Fig.6 Influence of EGCG on turbidity of α-LA solutions at pH value of 7.0

将不同含量EGCG加入蛋白溶液，当EGCG的添加量较少时，EGCG可以与蛋白通过疏水相互作用形成可溶性复合物，但当EGCG的添加量比较大时，EGCG可作为多齿配体，使蛋白形成二聚体。随着EGCG的添加量继续增多，蛋白之间以及蛋白-EGCG复合物之间的桥联继续增多，形成了粒径较大的聚集体，甚至产生沉淀[27]。从本实验结果中可以得出，当EGCG添加量低于0.05%时，EGCG与α-LA形成可溶性复合物；当EGCG添加量大于0.05%时，EGCG和α-LA形成了粒径较大的聚集体，使溶液的粒径和浊度增大。

未添加EGCG的α-LA溶液的浊度和EGCG添加量较小(0.002 5%～0.020 0%)时溶液的浊度相比较发现，后者的浊度比前者的浊度低，即少量EGCG的加入会使α-LA溶液的浊度降低，这与将少量EGCG(0.002 5%～0.020 0%)添加到α-LA溶液中使α-LA的粒径减小相一致。

由α-LA溶液粒径和浊度随EGCG添加量的变化可得，当EGCG添加量大于0.1%时，EGCG的加入使α-LA发生沉淀，没有足够的α-LA作为乳化剂稳定β-胡萝卜素，从而引起乳液的迅速失稳。

2.7 α-LA与EGCG相互作用热力学参数测定

在溶液中蛋白可以与EGCG相互作用，形成非共价复合物[26]。为了研究α-LA与EGCG相互作用机理，采用等温滴定量热仪测定了α-LA与EGCG的相互作用程度。α-LA与EGCG在相互作用过程中的热量变化如图7所示，图中Q、t、ΔQ分别代表热量、时间、热量变化值。图中表示EGCG滴定到样品池中的α-LA溶液后，补偿热功率随着滴定数变化的热功率曲线，每一个热功率峰代表着每一次滴定过程。热功率(dQ/dt)大于零表示反应为吸热反应。

将每一次滴定产生的热功率峰进行积分，减去对照的峰面积，即可求出在滴定过程中产生的热量，如图7所示。随着滴定次数的增加，ΔQ绝对值先增加后减小，最终维持在0附近。当ΔQ不再改变时，表示反应达到平衡，生成物的量不再变化。结果显示，反应的热量变化与配体浓度能够很好地符合多位点结合模型，因此，拟合的数据是有效的。在进行拟合时，第1个点的数据需要去掉，因为在第1次滴定前，等温滴定量热仪需要热平衡1 h，在平衡过程中，注射器中的配体会产生扩散，部分配体已经与样品发生反应，第1次滴定的有效体积会减少[28]。

图7 α-LA与EGCG相互作用的等温滴定量热测定Fig.7 Quantitative calorimetric determination of isothermal droplets under interaction of α-LA and EGCG

由表3可以得出，α-LA与EGCG的结合符合多位点结合模型，共有两个结合位点。其中结合位点1的结合常数K1是结合位点2的结合常数K2的5.5倍，因此，在α-LA分子中结合位点1对EGCG的结合强度更高。两个结合位点的反应焓变也存在显著差异，其中结合位点1的焓变为正值，而结合位点2的焓变为负值，这主要是由结合位点1比结合位点2的结合强度高所致。由α-LA与EGCG的结合比例(α-LA和EGCG结合物质的量之比)N1和N2可得，结合位点1中1分子α-LA可以与4分子EGCG结合；而结合位点2对EGCG的结合强度小，1分子α-LA可以与1分子EGCG结合。因此，在α-LA与EGCG的结合过程中，1分子α-LA可以与5分子EGCG结合。

表3 pH值7.0条件下ITC测定的α-LA与EGCG相互作用结果Tab.3 ITC analyses of EGCG reacting with α-LA at pH value of 7.0

将α-LA与EGCG混合溶液的粒径和浊度数据与ITC数据相结合可以发现，当EGCG的添加量小于0.1%时，α-LA与EGCG的物质的量之比小于1∶5，α-LA分子上有大量空闲的位置可以与EGCG结合；当EGCG添加量为0.1%时，α-LA与EGCG的物质的量之比为1∶4，α-LA与EGCG结合的第1个位点已经饱和，使α-LA溶液的粒径开始变大，形成了粒径比较大的非共价复合物，混合溶液的浊度开始增大。当EGCG添加量大于0.1%时，α-LA与EGCG的物质的量之比大于1∶5，溶液中粒径增大，并发生了沉淀。

3 结论

(1)EGCG添加量对pH值2.0和pH值7.0的乳液粒径、电位和包埋率没有显著性影响。这与EGCG添加量没有显著影响界面α-LA含量有关。在pH值7.0的乳液中，添加了EGCG的乳液粒径显著小于未添加EGCG乳液的粒径，这主要与EGCG的加入减少了α-LA分子间的团聚，促进其吸附到水油界面使乳液粒径减小有关。

(2)在pH值2.0的乳液中添加小于0.2%的EGCG对乳液的快速稳定性没有显著性影响，但当EGCG添加量大于0.2%时，随着EGCG添加量的增大，乳液的稳定性降低；将EGCG添加到pH值7.0的β-胡萝卜素乳液中时，添加量小于0.02%时，乳液的稳定性比未添加EGCG的乳液的稳定性高，当EGCG添加量大于0.02%时，随着EGCG添加量的增大，乳液的稳定性降低。

(3)在pH值7.0乳液中添加EGCG使乳液迅速失稳的机理中，随着EGCG添加量的增加，EGCG与α-LA混合溶液的粒径和浊度逐渐增大，当EGCG添加量大于0.1%时，混合溶液中形成了肉眼可见的复合物。通过ITC测定，α-LA与EGCG的反应是吸热反应，在α-LA分子上有两个位点可以与EGCG相结合。第1个位点的结合强度比较大，α-LA与EGCG的结合物质的量之比为1∶4；第2个位点的结合强度比较小，α-LA与EGCG的结合物质的量之比为1∶1。因此α-LA与EGCG的结合物质的量之比为1∶5。在pH值7.0以α-LA为乳化剂的乳液中添加EGCG作为抗氧化剂时，其添加量需小于0.1%。