宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状及其分子标记分析

， ， ，， ， ，， ，生祥

(1.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021； 2.宁夏农林科学院 农作物研究所，宁夏 银川 750001)

小麦(TriticumaestivumL.)是一种适应性强、分布广泛的世界性粮食作物，为全球35%～40%人口提供主粮。我国是世界上最大的小麦生产国和消费国，小麦年生产总量和消耗总量占世界小麦年生产总量的17%和消费总量的16%，小麦生产的持续发展对保障国家粮食安全具有重要意义[1]。随着人民生活水平的提高，对小麦品质的要求也逐渐提高，而我国小麦蛋白质含量平均为13.94%，面筋含量平均为30.40%，沉降值平均为32.10 mL，远不能满足人们的需求[2]。其中，蛋白质含量是小麦营养品质最重要的一项指标，而蛋白质质量由面筋含量、沉降值、流变学特性等加工品质决定[3]。因此，对于我国小麦品质改良来说，不仅要提高籽粒的蛋白质含量，更要改善和提高小麦加工品质[4-5]。蛋白质性状为小麦品质性状中的代表性性状，其贡献率比较大[6-7]。SHEWRY等[8]认为，表达的半胱氨酸肽酶基因数目与高分子质量麦谷蛋白亚基(High molecular weight glutenin subunit，HMW-GS)总量存在剂量关系，即小麦品质的改良可通过增加HMW-GS数目来实现；而低分子质量谷蛋白亚基(Low molecular weight glutenin subunit，LMW-GS)数量及HMW-GS、LMW-GS组合也对品质性状有重大影响[9]。另外，HMW-GS的1、2*、17+18、5+10亚基和LMW-GS的GluA3f、GluB3b、GluB3g亚基与面团形成时间和稳定时间均呈显著正相关，HMW-GS的N、1、14+15、17+18、7+8、2+12、3+12、4+12亚基和LMW-GS的GluB3d、GluB3f、GluB3h、GluB3g亚基与蛋白质和湿面筋含量均呈显著正相关[10]。因此，HMW-GS、LMW-GS的数目及组合形式直接决定小麦品质的优劣。

DNA分子标记和QTL定位技术的发展为小麦品质性状的分子检测提供了有效的方法。目前，利用分子标记对小麦不同群体的蛋白质含量、沉降值、淀粉含量等品质性状进行了大量研究[11-14]。同时，在QTL发掘方面，孙海艳等[15]共发现了15个分布在1D、3B、6D染色体上的蛋白质品质性状QTL。解树斌[16]发掘了涉及籽粒蛋白质含量的33个QTL，分布在1A、1B、4A、4B、6A染色体上，单个QTL的表型贡献率为6.69%～15.52%，LOD值最大为7.3，同时，检测到涉及沉淀值的33个QTL，分布在1A、1B、4B、5B、5D、6A、6D染色体上，单个QTL表型贡献率为4.62%～18.73%，LOD值最大为13.6。李红民[17]检测到1个控制小麦籽粒硬度的主效QTL，LOD值为10。郭利建等[18]检测到33个与品质性状相关的QTL，其中,11个为粗蛋白含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、4B染色体上，表型贡献率为0.69%～2.48%；12个为湿面筋含量QTL，分布在1A、3A、5A、6A、2B、3B、4B染色体上，表型贡献率为0.58%～2.37%；3个为沉降值QTL，分布在3A、1B、3B染色体上，表型贡献率为2.72%～11.31%。虽然小麦品质相关性状的QTL研究已有许多报道，但在育种上有利用价值的相关QTL还有待研究和应用。本研究针对宁夏回族自治区主栽小麦品种宁春4号综合农艺性状、适应性好，但品质一般，而育成于山西运城的河东乌麦籽粒蛋白质含量、面筋含量、沉降值均较高，在前期对2个小麦品种遗传性状与分子标记分析的基础上[19]，构建了杂交组合群体，对其F2进行品质性状及其分子标记分析，以期为宁夏回族自治区小麦品质性状改良发掘可供利用的育种中间材料和QTL。

1 材料和方法

1.1 试验材料

宁春4号为宁夏回族自治区主栽小麦品种，河东乌麦由运城学院杜磊博士提供。2016年在宁夏大学教学试验农场对宁春4号与河东乌麦进行正反交，同年将收获的杂交种子在云南南繁加代，2017年将收获种子种植于宁夏大学试验农场，单粒点播，每行10粒，行长1.1 m，行宽0.2 m，获得含331个单株的F2群体，其中正交后代201株(编号001—007、013—206)，反交后代130株(编号008—012、207—331)。

1.2 小麦品质性状的测定

用瑞典波通9200整粒谷物红外线分析仪测定籽粒含水量、硬度、蛋白质含量、沉降值、面筋含量[20]，在国家小麦改良中心西北分中心进行。

1.3 小麦品质性状的分子标记分析

基因组DNA的提取采用SDS法[21]。前期根据小麦的7个部分同源群设计了SSR标记，本研究利用能够在宁春4号与河东乌麦间稳定扩增的49个SSR标记[19]进行分析，其中对本研究材料品质性状有明确QTL定位结果的5个SSR标记的名称及序列见表1。2个分别与HMW-GS数目和面粉核黄素含量相关的标记Bx17、YP7A参照文献[22-23]，具体信息见表1。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 SSR标记信息

PCR反应体系：10×Reaction Buffer 1 μL，MgCl2(25 mmol/L)0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)0.8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL，模板DNA 100 ng，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.05 μL，加ddH2O至总体积10 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56～58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，34个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物检测：采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳时总电压为180 V，电泳约1.5 h，经银染后观察、照相，并统计扩增条带。

1.4 数据分析

采用Excel 2013对品质性状和分子标记结果进行统计；用SPSS 20进行方差、相关性和聚类分析；利用Origin 8.0对各品质性状的频率分布进行作图；采用Map Manager QTXb 20进行QTL定位，取概率值P<0.05的LOD值作为判断QTL存在的阈值，利用Kosambi函数中单标记回归分析方法进行QTL分析，即检测亲本间有多态性的引物在F2群体中的分布，根据电泳谱带结果建立SSR标记数据库：与母本相同的带型记为B，与父本相同的带型记为A，杂合带型记为H，缺失记为-。将331个F2单株的分子标记结果与品质性状数据相结合，运用Map Manager QTXb 20软件检测相关QTL位点，QTL命名方法为：小写字母q+目标性状的大写英文字母代称+所在染色体号数，QTL全称通常用斜体表示，如在5B染色体上，与穗长相关的QTL位点命名为qSL5B。

2 结果与分析

2.1 宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状分析

2.1.1 品质性状变异分析 对宁春4号与河东乌麦杂交F2的331个单株的5个品质性状进行分析(图1)发现，5个品质性状在F2均出现较大分离，达到极显著水平(P<0.01)，均呈连续正态分布，符合多基因控制的数量性状的遗传特点，并且出现了许多具有超亲性状的单株。

对F2群体品质性状进行变异分析(表2)发现，籽粒蛋白质含量、硬度、面筋含量和沉降值的群体平均值均超过高亲亲本，含水量的群体平均值介于高亲亲本与低亲亲本之间。其中，含水量、蛋白质含量、面筋含量、硬度、沉降值的超中亲比例分别达77.78%、84.52%、92.46%、73.41%、99.60%，超高亲比例分别达46.63%、82.94%、90.48%、66.27%、99.60%。5个品质性状的变异系数表现为沉降值(39.54%)>面筋含量(19.91%)>硬度(17.10%)>蛋白质含量(12.63%)>含水量(3.87 %)。

图1 宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状频率分布Fig.1 Frequency distribution of quality traits in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

品质性状Quality traits宁春4号Ningchun No.4河东乌麦Hedong black wheat变异幅度Variation range平均值Mean标准差Standard deviation变异系数/%Coefficient of variationF超中亲比例/%Proportion ofultra-mid parent超高亲比例/%Proportion of ultra-high parent含水量/%Water content 10.0110.759.59～11.8310.720.423.8729.533∗∗77.7846.63蛋白质含量/%Protein content 12.5612.7210.70～18.9014.711.8612.6344.511∗∗84.5282.94面筋含量/%Gluten content22.6924.0616.93～52.5932.036.3819.91748.126∗∗92.4690.48硬度/%Hardness48.6445.4116.41～72.2150.988.7217.10788.502∗∗73.4166.27沉降值/mLSedimentation value17.8817.9610.40～68.4534.7713.7539.54996.946∗∗99.6099.60

注：**表示在 0.01水平上的变异。

Note：** means variation degree at 0.01 level.

2.1.2 基于品质性状的聚类分析 基于籽粒含水量、蛋白质含量、面筋含量、硬度和沉降值5个品质性状对F2群体进行聚类分析，在遗传距离为10 cM时，F2群体被分成5个类群(图2)，其中，含水量表现为Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，蛋白质含量表现为Ⅱ>Ⅰ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ，面筋含量表现为Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ>Ⅰ，硬度表现为Ⅴ>Ⅳ>Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ，沉降值表现为Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ>Ⅴ。总体上，类群Ⅰ单株平均沉降值最大(60.13 mL)，类群Ⅱ单株平均蛋白质含量(17.26%)、面筋含量(38.78%)最高，类群Ⅲ单株平均蛋白质含量、面筋含量、沉降值也较高，分别为16.42%、37.75%、48.24 mL；类群Ⅴ单株平均含水量(10.90%)、硬度(54.23%)最大。

图2 宁春4号与河东乌麦杂交F2 5个类群的品质性状

2.1.3 品质性状的相关性分析 对F2群体的5个品质性状进行相关性分析(表3)发现，蛋白质含量与面筋含量(r为0.94)、沉降值(r为0.93)均呈极显著正相关，与含水量(r为-0.30)、硬度(r为-0.18)均呈极显著负相关；含水量与硬度(r为0.49)呈极显著正相关，与面筋含量(r为-0.29)、沉降值(r为-0.35)均呈极显著负相关；面筋含量与沉降值(r为0.89)呈极显著正相关；硬度与沉降值(r为-0.27)呈极显著负相关。

表3 宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状相关性分析

注： **表示在0.01水平上极显著相关。

Note：** means significant correlation at 0.01 level.

2.2 宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状分子标记分析

2.2.1 品质性状相关分子标记辅助选择 利用在亲本间有差异的2个分别与HMW-GS数目和面粉核黄素含量相关的标记Bx17和YP7A，对其在F2群体中的分布情况进行检测(图3、表4)发现，331个单株中，有233个单株携带Bx17基因，占群体总数的70.39%；有294个单株携带Psy-A1基因，占总数的88.82%；有206个单株同时携带Bx17和Psy-A1基因，占总数的62.24%。

M：DL2000；W：空白对照；P1：宁春4号；P2：河东乌麦；1—331：F2单株M:DL2000;W:Blank control;P1:Ningchun No.4;P2:Hedong black wheat;1—331:F2 individual plants图3 标记Bx17在宁春4号与河东乌麦杂交F2中的扩增结果Fig.3 Amplification of Bx17 in F2 hybrids from Ningchun No.4 and Hedong black wheat

标记名称Marker name基因Genes性状Traits株数Plant numberBx17Bx17HMW-GS数目233YP7APsy-A1面粉核黄素含量294Bx17/YP7ABx17/Psy-A1HMW-GS数目/面粉核黄素含量206

2.2.2 品质性状的QTL定位 利用能够在宁春4号与河东乌麦间稳定扩增的49个SSR标记对F2群体进行检测，其中，5个标记对品质性状有明确的QTL定位结果(表5)，这5个标记共检测到8个与品质性状相关的QTL，表型贡献率为3%～5%，LOD值最大为9.40，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5条染色体。其中，共检测到2个蛋白质含量QTL位点，分布在2条染色体上(1B、5D)，加性效应分别为-0.42、0.23，LOD值最大为7.60；共检测到1个含水量QTL位点，分布在7B染色体上，加性效应为-0.04，LOD值为7.20；共检测到1个面筋含量QTL位点，分布在1B染色体上，加性效应为-1.62，LOD值为9.40；共检测到2个硬度QTL位点，分布在2条染色体上(5A、5B)，加性效应分别为-2.93、-1.95，LOD值最大为9.40；共检测到2个沉降值QTL位点，分布在2条染色体上(1B、5D)，加性效应分别为-2.95、1.86，LOD值最大为7.50。综上，1B染色体上检测到蛋白质含量、面筋含量和沉降值QTL，5D染色体上检测到蛋白质含量和沉降值QTL，这2条染色体存在不同品质性状的QTL富集区。

表5 宁春4号与河东乌麦杂交F2品质性状QTL分析

3 结论与讨论

长期以来，高产作为小麦育种的基本目标，要求亲本具有较高产量水平[24]。高蛋白质含量是品种选育的另一要求。亲本选配时要求双亲之一的蛋白质含量高，而另一亲本在这方面不应过低[25-27]；蛋白质含量的遗传力较高，变异受环境影响较小，应从早期世代开始进行选择[28-31]。F2群体是早期世代选择的理想群体，各遗传性状处于高度分离状态，能够提供最大的数量遗传信息。本研究表明，5个品质性状在F2群体中均出现较大分离，达到极显著水平，均呈连续正态分布；蛋白质含量、面筋含量、硬度、沉降值的群体平均值均超过高亲亲本，超高亲比例分别达82.94%、90.48%、66.27%、99.60%，含水量的群体平均值介于高亲亲本与低亲亲本之间，超中亲比例达77.78%，超高亲比例达46.63%；类群Ⅱ、类群Ⅲ的蛋白质含量、面筋含量和沉降值均较高，为优质类群；蛋白质含量与面筋含量和沉降值、含水量与硬度、面筋含量与沉降值均呈极显著正相关，而蛋白质含量与含水量和硬度、含水量与面筋含量和沉降值、硬度与沉降值均呈极显著负相关。育种实践中，产量、品质性状、抗病性之间往往存在负相关性，品质性状各指标间也存在或多或少的负相关性，很难做到各个性状都达到设定的育种目标，为此在择优选择的同时，还要保持各性状间的协调性。今后还需进一步分析不同世代的品质性状及遗传特性，以便更准确地掌握品质性状的变异规律。

DNA分子标记技术是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的，可直接反映生物个体在DNA水平上的差异。分子标记为小麦品质性状分析提供了新的遗传标记类型。近年来，利用分子标记辅助选择小麦蛋白质相关基因的研究已取得了一定进展[22-23,32-33]。本研究利用2个品质性状相关标记Bx17和YP7A对F2331个单株进行检测发现， 233个单株携带Bx17基因，294个单株携带Psy-A1基因，206个单株同时携带Bx17和Psy-A1基因。同时，利用新开发的5个SSR标记共检测到8个不同品质性状QTL位点，涉及5A、1B、5B、7B、5D等5条染色体，加性效应为-2.93～1.86，表型贡献率为3%～5%，LOD值最大为9.40。同时，1B染色体上检测到蛋白质含量、面筋含量和沉降值3个性状的QTL，5D染色体上检测到蛋白质含量和沉降值2个性状的QTL，这2条染色体存在品质性状的QTL富集区，可作为进一步研究的重点。本研究共检测到蛋白质含量QTL 2个，分布于1B、5D染色体上，表型贡献率均为4%；含水量QTL 1个，分布于7B染色体上，表型贡献率为4%；面筋含量QTL 1个，分布于1B染色体上，表型贡献率为5%；硬度QTL 2个，分布于5A、5B染色体上，表型贡献率分别为5%、4%；沉降值QTL 2个，分布在1B、5D染色体上，表型贡献率分别为3%、4%。在今后研究中，还需进一步开发高效的分子标记，通过构建高密度的物理图谱，进而使得与品质性状相关的QTL(尤其是主效QTL)得以精细定位，为小麦重要品质性状QTL发掘、研究、应用奠定基础。