SDF-1α/CXCR4信号促进骨髓间充质干细胞对海水吸入性肺损伤的治疗作用

宋斯迪 鲁 曦 金发光 梁 源 鱼高乐

近年来，随着海上活动的增加，海水淹溺事件呈逐年增多之势，而肺脏是海水淹溺侵害损伤的首要器官[1]。海水进入肺内可迅速破坏肺泡上皮细胞屏障，导致肺组织屏障通透性增加，蛋白渗出至肺泡腔，引起肺间质和肺泡腔严重水肿，称为海水吸入性肺损伤(seawater drowning induced acute lung injury, SWD-ALI)，表现为严重的呼吸困难和低氧血症[2-4]。研究表明，海水吸入导致的肺损伤明显比淡水严重，也更容易发展成为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)，这与海水的高渗透压、偏碱等理化性质有关[1]。ALI/ARDS是临床常见的急重症之一，发病机制尚未完全阐明，病情进展快，目前尚无十分有效的救治方法。

近来，干细胞领域取得的一系列研究进展使得干细胞治疗ALI/ARDS成为可能。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)是源于骨髓支持结构的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，且具有取材方便，免疫排斥反应弱等优点[5]。动物实验显示，BMMSCs能够通过抑制炎症、降低肺上皮细胞通透性等改善多种因素导致的急性肺损伤[6-8]。BMMSCs对肺损伤的修复需要其向肺组织的迁移归巢、定植、分化[1]。然而，目前BMMSCs在肺损伤模型中的低定植率和低分化率仍然是其治疗效果不佳的重要原因[2,9]。基质细胞衍生因子-1α(SDF-1α)及其受体CXC趋化因子受体4(CXCR4)在介导间充质干细胞定向迁移过程中发挥着关键作用[10]。本文通过观察异体移植BMMSCs对海水吸入性肺损伤的治疗作用，并观察SWD-ALI模型中内源性SDF-1α和CXCR4表达变化，旨在明确SDF-1α对BMMSCs迁移及其对SWD-ALI治疗效果的影响。

材料和方法

一、实验材料

海水为中国国家海洋局第三海洋研究所提供的我国东南沿海海水，主要成分：渗透压1 300 mOsm/L，pH 8.2，比重1.05，NaCl 26.518 g/L，MgSO43.305 g/L，MgCl22.447 g/L，CaCl21.141 g/L，KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L。RNAiso Plus，PrimeScriptTMRT reagent Kit和TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ购买于TaKaRa公司(日本)。AMD3100(MCE，美国)，SDF-1α(PeproTech，美国)，Transwell小室(Corning，美国)，CXCR4一抗(CST，美国)和SDF-1α一抗(Santa Cruz，美国)，CD29一抗(Santa Cruz)，HRP标记羊抗小鼠、羊抗兔二抗(碧云天，中国)。FBS和DMEM培养基购于Thermo公司(美国)。

二、实验动物和分组

雄性SD大鼠(空军军医大学实验动物中心)40只，8～10周龄，200～220 g，SPF级，清洁级动物实验室饲养，温度18～26 ℃，相对湿度45%～70%，12 h/12 h光暗周期。SD大鼠随机分为对照组(CON组)，海水吸入性肺损伤模型组(SW组)，海水吸入+BMMSCs治疗组(SW+BMMSCs组)，海水吸入+BMMSCs治疗+CXCR4阻断组(SW+BMMSCs+ AMD3100组)，海水吸入+BMMSCs治疗+SDF-1α给药组(SW+BMMSCs+ SDF-1α组)，每组8只动物。所有动物实验均依据空军军医大学实验动物操作规程执行，符合本单位动物实验伦理道德规范。

三、实验方法

1. 海水吸入性肺损伤模型建立和动物处理: 1.5%巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉大鼠，仰卧固定于动物手术台，1 ml注射器插入气管至隆突1.5～2 cm处，在20～30 min内匀速注入4 ml/kg海水。BMMSCs治疗和CXCR4阻断组大鼠分别于尾静脉注射1×106个BMMSCs或AMD3100预处理的BMMSCs，24 h后造模。SDF-1α给药组在造模海水中加入200 ng/ml的SDF-1α。各处理组在造模后4 h取肺组织样本，进行后续检测。

2. BMMSCs分离培养： SD大鼠用1.5%巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉后，颈椎脱位法处死，严格无菌条件下，取双侧股骨和胫骨，剪去骨骺端，暴露骨髓腔，用含1% FBS的DMEM培养基冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，反复吹打制成单细胞悬液，接种后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，24 h后全量换液，后每3 d全量换液一次，待贴壁细胞达到80%～90%融合后，按1︰2比例传代。倒置显微镜下观察BMMSCs细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29。

3. Transwell迁移实验： 将BMMSCs细胞(1×105个/ml)接种于Transwell小室上层，小室下层为含5% FBS的DMEM培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h。使用AMD3100(10 μg/ml)37 ℃预处理BMMSCs细胞2 h阻断CXCR4，下层培养基中分别加入0、100、150、200 ng/ml的SDF-1α。结束后，4%多聚甲醛固定Transwell 小室20 min，0.5%结晶紫染液染色5 min，在倒置显微镜下(200×)对迁移至微孔膜下层的细胞计数，每个样本选取5个视野，取均数。

4. 肺组织HE染色： 1.5 %巴比妥钠(2 ml/kg)麻醉后处死动物，取出肺脏，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋后制成5 μm切片。脱蜡后进行常规苏木素-伊红(HE)染色，镜检。

5. Real-time PCR检测： 使用RNAiso Plus试剂按照说明提取肺组织总RNA。Nanodrop 2000(Thermo，美国)测定RNA浓度后，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit反转录为cDNA。采用TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒，按照说明书，使用CFX96TMReal-time System(Bio-Rad，美国)进行Real-time PCR检测。引物序列，见表1。

表1 real-time PCR引物序列

6. Western blot检测： RIPA裂解液研磨裂解提取肺组织蛋白，4 ℃离心，取上清。8% SDS-PAGE凝胶电泳，250 mA、80 min转至PVDF膜。CXCR4一抗(1︰1 000)和SDF-1α一抗(1︰500)4 ℃孵育过夜。HRP标记羊抗小鼠、羊抗兔二抗(1︰1 000)室温孵育1 h。化学发光经凝胶成像系统(Bio-Rad，美国)曝光检测。

四、统计学方法

结 果

一、骨髓间充质干细胞观察鉴定

光镜下可见分离的BMMSCs贴壁生长，均匀分布，多数呈长梭形、卵圆形，少数呈三角形、多角形，表现为骨髓间充质干细胞的典型形态，见图1A。流式细胞仪检测显示BMMSCs表面标志物CD29在绝大多数细胞呈强阳性表达，见图1B、C。

二、SDF-1α/CXCR4信号对BMMSCs迁移的影响

Transwell实验结果显示，在下层培养基中添加SDF-1α可显著增加穿过微孔膜的BMMSCs细胞数，并呈剂量反应关系。CXCR4阻断剂AMD3100预处理BMMSCs，则显著拮抗了SDF-1α对BMMSCs迁移的促进作用(&&)，但SDF-1α仍可部分促进AMD3100预处理的BMMSCs细胞迁移(##)，见图2A、B。

三、海水吸入和BMMSCs治疗对肺组织SDF-1α和CXCR4表达的影响

检测海水损伤以及BMMSCs治疗后肺组织本身SDF-1α和CXCR4的表达变化，结果显示，海水吸入显著提高了大鼠肺组织CXCR4和SDF-1α的mRNA水平。相比单纯海水吸入损伤，BMMSCs治疗可更进一步增加肺组织CXCR4和SDF-1α的mRNA表达，见图3A、B。蛋白表达与mRNA表达表现出了相似的趋势，海水损伤显著提高了肺组织CXCR4和SDF-1α的蛋白含量，BMMSCs治疗更进一步促进了CXCR4和SDF-1α的蛋白表达。但是，BMMSCs促进的mRNA和蛋白表达均被AMD3100预处理拮抗，见图3C。

图1 骨髓间充质干细胞鉴定；注：A：光镜观察骨髓间充质干细胞；B：流式细胞检测IgG阴性对照；C：流式细胞检测表面标志物CD29

四、CXCR4在BMMSCs治疗海水吸入性肺损伤中的作用

HE病理染色显示，见图4A，海水吸入导致大鼠肺泡腔内严重的渗出、水肿和炎症细胞浸润，肺泡壁内也可见明显的水肿和炎症细胞。BMMSCs治疗显著减轻了海水吸入后肺泡腔和肺泡壁的渗出、水肿和炎症细胞聚集。CXCR4阻断剂AMD3100预处理BMMSCs，相较单纯海水损伤组，虽然明显改善了肺泡腔和肺泡壁的水肿和炎症，但与BMMSCs治疗组相比，表现为更严重的肺泡腔和肺泡壁的水肿、渗出和炎性细胞浸润。与上述结果一致，海水吸入显著增加了肺脏的湿干重比，BMMSCs治疗可显著降低海水吸入导致的肺湿干重比，而AMD3100则阻断了BMMSCs的这一治疗效应，见图4B。

五、SDF-1α在BMMSCs治疗海水吸入性肺损伤中的作用

与上述结果相似，海水吸入导致了严重的肺损伤(渗出、水肿、炎症)，BMMSCs治疗则可显著减轻海水吸入引起的肺损伤。重要的是，BMMSCs治疗合并肺部SDF-1α给药，进一步减轻了海水吸入导致的肺损伤，见图5A。同样，合并SDF-1α肺部给药，进一步促进了BMMSCs治疗引起的肺湿干重比降低，见图5B。

图2 SDF-1α/CXCR4对骨髓间充质干细胞迁移的影响；注：A：Transwell微孔膜结晶紫染色；B：迁移BMMSC细胞数统计；*，**：P<0.05和0.01与“AMD3100(-)，SDF-1α (0)”组比较；##：P<0.01与“AMD3100(+)，SDF-1α (0)”组比较；&&：对应组比较P<0.01

图3 海水吸入和BMMSCs治疗对肺组织SDF-1α和CXCR4表达的影响；注：A：RealPCR海水吸入和BMMSCs治疗对CXCR4 mRNA表达的影响； B：海水吸入和BMMSCs治疗对SDF-1α mRNA表达的影响；C：Western blot检测海水吸入和BMMSCs治疗对CXCR4和SDF-1α蛋白表达的影响；*，**：P<0.05和0.01与对照相比；##：P<0.05与对应组相比

图4 海水吸入和BMMSCs治疗对肺组织病理和湿干重比的影响；注：A：海水吸入和BMMSCs治疗后肺组织HE染色(×100)；B：海水吸入和BMMSCs治疗后肺湿干重比统计； *，**：P<0.05和0.01与对照相比；#，##：P<0.05和0.01与对应组相比；n.s.：无统计学差异

图5 SDF-1α对BMMSCs治疗海水吸附性肺损伤的影响；注：A：BMMSCs及复合SDF-1α治疗后肺组织HE染色(×100)；B：BMMSCs及复合SDF-1α治疗后肺湿干重比统计； *，**：P<0.05和0.01与对照相比；#，##：P<0.05和0.01与对应组相比

讨论

海水淹溺性肺损伤致病机理复杂，目前尚未完全阐明。研究认为，海水吸入后的多种致病因子，如海水高渗、高碱、破坏肺泡表面活性物质等损伤肺内皮细胞，引起炎症失控，破坏肺泡/毛细血管屏障，导致肺泡和肺间质的渗出、水肿[1-11]。针对上述病因病理，目前治疗方法主要集中于去除病因因素，同时对损伤的器官进行功能支持，以减少损伤的细胞数量和程度，如早期肺泡灌洗、机械通气、补充肺泡表面活性物质、给予高压氧疗和激素等[1]。然而这些治疗措施并不能有效的促进损伤细胞的修复，终止SWD-ALI病理进程，仅能部分改善临床症状。

BMMSCs已经被多个实验研究用于肺部损伤和疾病的治疗，并取得了良好的效果。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)引起的小鼠急性肺损伤模型中，静脉注射BMMSCs可抑制肺炎症因子释放，减少肺组织胶原纤维，并可分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞，综合作用参与肺部损伤重塑[12]。在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary, COPD)动物模型中，BMMSCs通过抑制炎症信号和炎症因子释放，并加强巨噬细胞吞噬功能，有效减轻COPD的肺损伤[13]。此外，BMMSCs还被研究用于治疗、改善百草枯、缺血再灌注、辐射和支气管发育不良等多种因素引起的肺损伤[14-17]。先前的一项研究显示，在SWD-ALI中，BMMSCs可通过抑制肺部细胞自噬，减轻肺损伤程度[18]。与先前研究结果相一致，本文同样表明，异体BMMSCs移植显著减轻了SWD-ALI肺泡渗出、肺泡和肺泡间隔水肿、炎症细胞浸润，并降低了SWD-ALI肺组织的湿干比。这些结果表明，BMMSCs移植是SWD-ALI后一个潜在的有效治疗措施。

BMMSCs在损伤肺部发挥修复作用需要BMMSCs向损伤肺部的迁移和定植[1-2]。然而，BMMSCs在肺损伤组织模型中的低迁移、移植率限制了BMMSCs对肺损伤的治疗作用[19]。有研究表明，损伤肺组织能够释放多种趋化因子，并表达特异性受体或配体，引导趋化BMMSCs迁移并黏附于损伤部位[1]。在调控间充质干细胞定向迁移过程中，SDF-1α及其受体CXCR4被认为发挥关键作用[10]。本实验研究发现，在SWD-ALI模型中，损伤肺组织中SDF-1α和CXCR4的基因和蛋白表达均明显升高，表明SWD-ALI本身可一定程度启动内源性BMMSCs的动员、迁移和定植。进一步使用CXCR4阻断剂AMD3100预处理BMMSCs，显著抑制了BMMSCs对SWD-ALI损伤的修复作用，表明SDF-1α/CXCR4信号参与了BMMSCs对SWD-ALI损伤的修复和治疗过程。与本文相一致，先前的另一项研究也发现在BMMSCs高表达CXCR4，可显著促进BMMSCs对百草枯导致的肺损伤的治疗[20]。体外实验显示，SDF-1α可促进培养的BMMSCs迁移，而动物肺部给予SDF-1α进一步促进了BMMSCs对大鼠SWD-ALI的治疗效果，从另一方面也证明SDF-1α/CXCR4信号在SWD-ALI模型中，可促进BMMSCs向损伤肺组织的迁移，并具有对肺组织的修复作用。

本研究结果表明，BMMSCs异体移植可有效改善和治疗SWD-ALI。在此过程中，SDF-1α/CXCR4信号在促进BMMSCs向损伤肺组织迁移、定植和修复肺损伤的过程中发挥了重要作用。BMMSCs联合肺部SDF-1α给药可显著促进其对SWD-ALI的治疗效果。