姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌p38 MAPK的表达及抗氧化能力的影响

杨 栋，莫中成

过度训练是一种大强度运动，可导致运动员骨骼肌组织中活性氧（reactive oxy gen species，ROS）的生成增加，细胞抗氧化和氧化平衡被破坏，骨骼肌发生过劳性损伤（常波 等，2014；肖卫华 等，2014）。因此，运动过程中，如果机体的抗氧化能力得到改善，可有效预防训练时骨骼肌损伤。

姜黄素（curcumin）是姜黄根中重要的活性成分之一，属二酮类化合物，在抗炎、抗衰老、抗肿瘤、利胆、抗氧化等方面具有非常广谱的生物学作用（郑佳 等，2013；周瑶瑶 等，2016；Jin et al.，2015；Nagahama et al.，2015）。研究发现，姜黄素可以清除体内的氧自由基，是一种高效抗氧化剂（池爱平 等，2006）。但在运动损伤中，姜黄素是否可以影响骨骼肌的氧化应激状态仍不清楚。本研究以负荷游泳训练创建过度训练大鼠模型，观察姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌抗氧化能力的影响，并探讨其初步分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选取7周龄Wistar雄性大鼠40只，平均体重为223.35±16.23 g，均由南华大学实验动物部提供。所有大鼠均饲以基础饲料和蒸馏水，常规饲养，自由饮食。适应饲养3天以后，随机分为4组：空白对照组（control group，CG）、有氧训练组（aerobic training group，ATG）、过度训练组（overtraining group，OG）、过度训练+姜黄素干预组（overtraining and curcumin-treated group，OCG），每组10只。训练时，每组大鼠自由摄食和饮水，OCG组每天以100 mg/kg姜黄素灌胃1次，其他组予以相应体积的生理盐水灌胃作为对照。

1.2 试剂来源与训练方案

姜黄素为Sigma公司分装，TRIzol试剂、PVDF膜购自Invitrogen公司，扩增用引物由上海生工公司合成，逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒购自长沙佳和生物科技有限责任公司，p38 MAPK一抗及HRP标记的IgG二抗购自Abcam公司，SOD活性、MDA含量、 CK活性和 LDH活性检测试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

训练方案参考文献进行（崔笑梅 等，2017），具体方案如下：CG组不进行任何运动训练，ATG组每天进行无负重游泳训练60 min。OG组和OCG组每天进行递增负荷游泳运动，即第1～3周，不负重，只递增运动时间以增加运动负荷（第1周5～30 min，第2周30～60 min，第3周60～120 min）；第4～6周固定运动时间并增加运动负荷量（第4周负荷1%～2%体重，第5周负荷2%～4%体重，第6周负荷4%～6%体重）。游泳用玻璃槽水深50 cm，温度为31.0±2.0℃，箱底放置有水泵，防止大鼠静止在水面。训练期间，每周训练6天，休息1天，全程共6周。

1.3 取材与检测

大鼠于末次训练结束后，经戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉处取全血置抗凝管，取血清检测血清睾酮，以评价大鼠过度训练模型的建立情况。同时分离大鼠两侧的深层腓肠肌，冰PBS漂洗后置于超低温保存备用。采用分光光度法测定骨骼肌SOD活性及MDA含量，乙酰半胱氨酸法检测血清中CK活性，苯肼显色法检测血清中LDH 活性，所有指标检测均严格按试剂盒的操作说明执行。

1.4 实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） 检测mRNA的含量

采用TRIZOL法常规提取组织总RNA，经紫外线分光光度仪测定其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间，按试剂盒说明先进行逆转录，再以其cDNA产物进行实时荧光定量PCR。定量PCR反应按试剂盒说明书进行，采用25 μl的反应体系，其中含有SYBR green mix（2x） 12.5 μl，ddH2O 8.5 μl，cDNA 2μl，上下游引物各1 μl。扩增程序：95℃ 10 min，扩增循环95℃ 10 s，58℃ 15 s，72℃ 20 s，共40个循环，72℃采集荧光信号，每组重复实验3次。

1.5 Western blot检测蛋白质的表达

采用RIPA裂解液常规裂解骨骼肌组织，以BCA法进行蛋白质定量检测，蛋白变性后以每孔20 μl的上样量进行SDS-PAGE垂直电泳（分离胶浓度为10%），再经半干电转移至PVDF膜上，4%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗置于4℃冰箱摇床孵育过夜，取出后以0.1% Tween-PBS漂洗3次（每次5 min），再室温孵育辣根过氧化物酶标记的二抗1 h，经0.1%Tween-PBS洗3次（每次5 min），最后以蛋白质印迹发光检测试剂盒显示于Tanon化学发光成像分析系统，计算分析蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析

实验数据均以均数±标准差（M±SD）表示，两组间比较采用方差分析及t检验，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，以P＜0.05为差异有显著性意义。

2 结果与分析

2.1 训练结束后大鼠血清睾酮的变化

为期6周的训练结束后，CG组、ATG组大鼠状态正常，而OG组大鼠则表现出神态倦怠，易受惊吓等症状。血睾酮水平是反映疲劳的消除和体现运动能力变化的重要指标，结果显示，OG组的血清睾酮水平显著下降（P＜0.05），提示大鼠过度训练模型建立成功。而OCG组大鼠血清睾酮的水平有所上升（P＜0.05），提示姜黄素可以在一定程度上缓解过度训练导致的大鼠血清睾酮水平的下降（图1）。

图1 各组大鼠血清睾酮水平的变化Figure 1. Changes of Serum Testosterone Levels in Each Group

2.2 姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量，以及血清中CK和LDH活性的影响

训练结束后，采用试剂盒分别检测各组大鼠骨骼肌组织中SOD活性和MDA含量（表1），与CG组比较，ATG组大鼠的SOD、CK和LDH活性无显著变化（P＞0.05），而OG组SOD活性显著下降，CK和LDH活性则显著上升（P＜0.05），但是增加姜黄素干预的OCG组大鼠SOD的活性明显高于单纯的OG组，而CK和LDH活性则低于单纯的OG组（P＜0.05）。骨骼肌MDA的含量，ATG组与CG组无显著差别（P＞0.05），但是OG组较CG组明显升高（P＜0.05）；而与单纯OG组比较，OCG组大鼠MDA的含量测显著降低（P＜0.05）。

2.3 姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA和蛋白表达的影响

训练结束后，采用荧光定量PCR试剂盒检测各组大鼠骨骼肌组织中p38 MAPK mRNA的表达含量（图2），与CG组和ATG组比较，OG组大鼠的p38 MAPK mRNA的表达上调（P＜0.05）；而与OG组比较，增加了姜黄素干预的大鼠骨骼肌p38 MAPK mRNA的表达则下调（P＜0.05）。

图2 姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌P38 MAPK mRNA表达的影响Figure 2. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK mRNA in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

采用Western blotting检测各组大鼠骨骼肌组织中p38 MAPK 蛋白的表达（图3），与CG组和ATG比较，OG组大鼠p38 MAPK 蛋白质的表达上调（P＜0.05）；而与OG组比较，增加了姜黄素干预的大鼠骨骼肌p38 MAPK蛋白质的表达则下调（P＜0.05）。

表1 各组大鼠骨骼肌SOD活性和MDA含量以及血清中CK和LDH活性的变化Table 1 Changes of SOD Activity，MDA Content，CK Acitvity and LDH Activity in Skeletal Muscle of Rats （n=5）

3 讨论

随着竞技体育竞争越发激烈，运动员训练强度逐渐加大，更容易出现过度训练导致运动员骨骼肌受损。因此，预防过度训练所造成的损伤以及探讨过度训练导致骨骼肌损伤的机制成为运动医学的重要研究领域（Gandra et al.，2012；Pereira et al.，2013）。本研究应用游泳训练的方式建立过度训练大鼠模型，检测了反映过度训练状况的常用指标血清睾酮的水平。结果发现，OG组大鼠的血清睾酮水平显著下降，说明大鼠出现了运动性疲劳低血睾酮水平，结合大鼠机体状况的表现，证实过度训练大鼠模型建立成功。

过度训练导致损伤的机制较为复杂，目前尚无统一的认识。机体在过度训练时，组织的耗氧量会增加，产生的氧自由基也会增加，这样会使机体内抗氧化剂及合成抗氧化酶的成分过度消耗，如果不能及时补充，就会引起机体抗氧化能力的下降，从而使氧自由基的清除能力减弱，进而损伤骨骼肌细胞的细胞器，从而影响运动能力（Merry et al.，2016；Shill et al.，2016）。因此，机体抗氧化能力的保护，是增加肌肉承受更大运动强度能力的一个关键因子。本研究中，过度训练的大鼠SOD活性显著降低，MDA含量增高，表明过度训练可以降低大鼠骨骼肌的抗氧化能力，血清中CK和LDH 活性明显增高，提示骨骼肌组织存在损伤。

图3 姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌p38 MAPK 蛋白表达的影响Figure 3. Effects of Curcumin on the Expression of p38 MAPK Protein in Skeletal Muscle of Over-trained Rats

姜黄素提自于姜黄根，属于姜科，是咖喱食品中的主要成分，被广泛应用于传统的中医治疗。姜黄素是姜黄根中具有治疗活性的主要物质之一，在骨骼肌损伤的保护过程中也有重要作用。吴珊等（2016）研究发现，姜黄素能通过抑制炎性因子分泌及泛素-蛋白酶体关键分子表达，缓解免疫应激大鼠骨骼肌蛋白质降解。姜黄素可通过抑制NF-κB 表达，从而促进C2C12 骨骼肌细胞的增殖分化（魏连波 等，2015）。高超等（2017）认为，姜黄素对小鼠急性游泳训练导致的骨骼肌损伤具有保护作用，其机制主要是通过其抗氧化作用。已有研究发现，姜黄素结构中富含酚羟基，可通过抑制氧化酶、激活和保护抗氧化酶系等方式，清除氧自由基，进而保护细胞膜结构和功能，减轻细胞损伤。本研究中，在建立过度训练大鼠模型的基础上，采用了姜黄素干预。结果发现，姜黄素可以提高过度训练大鼠骨骼肌SOD的活性，降低MDA含量及血清中CK和LDH 的活性，提示姜黄素在一定程度上可以提高过度训练损伤后骨骼肌的抗氧化能力，并对骨骼肌的疲劳性损伤产生缓解作用。

MAPK是细胞内重要的蛋白激酶之一，其介导的信号通路可以将胞外刺激信息传导至胞核内，调控基因的转录和表达，从而参与细胞的多种生物学功能。p38 MAPK是MAPK家族的重要一员，有研究发现，过度的氧自由基聚积可以激活p38 MAPK，从而活化MAPK系统，进而影响骨骼肌细胞的功能（李琳燕，2011；Martinez et al.，2016）。本研究检测了p38 MAPK的表达情况，结果发现，OG组大鼠骨骼肌组织p38 MAPK的mRNA和蛋白表达上调，而应用姜黄素干预后，在一定程度上可以使大鼠骨骼肌组织p38 MAPK的mRNA和蛋白表达下调，提示p38 MAPK在过度训练所致的大鼠骨骼肌损伤中有一定的作用，而且参与了姜黄素对骨骼肌疲劳性损伤的缓解作用。

4 结论

过度训练可以导致骨骼肌组织抗氧化能力下降，造成骨骼肌疲劳性损伤，而应用姜黄素干预后，可以有效缓解过度训练所导致的机体氧化与抗氧化系统的失衡，并下调p38 MAPK的表达，提高抗氧化能力，从而缓解运动性疲劳的发生与发展。