益生菌与孤独症谱系障碍的关系研究进展*

孤独症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder，ASD)是一种神经发育障碍，童年早期起病，其特征是交流交往障碍、刻板重复行为以及兴趣范围狭窄，常共病胃肠问题、偏食、癫痫、多动和睡眠障碍等，是遗传因素和复杂环境因素共同作用的结果[1]。近年来，报道ASD的患病率逐渐升高，提示环境因素也对ASD的病因学有重要意义。关于肠道微生态失调与ASD的关系早已引起了学者们广泛关注，并进行了大量研究，有人提出伴有胃肠功能障碍的ASD为一特殊亚型，肠道微生态失调在其病因学方面起着重要作用，修复肠道微生物失调可能对治疗ASD核心症状有效[2，3]。益生菌是有活性的微生物产品，提供合适数量的益生菌对人和动物有益，动物实验和人类研究初步认为益生菌对ASD儿童有效，能改善肠道微生物生态失调、修复胃肠功能，并减轻ASD患者的行为异常[4,5]。为了给ASD患儿提供新的治疗思路，广泛评价益生菌对ASD的疗效，现综述相关研究。

1 伴有胃肠功能障碍的ASD为一特殊亚型

ASD是一种神经发育性综合征，病因学具有较大的异质性。Slattery J等[3]提出伴有肠道微生物改变的ASD可能是一特殊亚型，原因是肠道微生态失调(Gut Dysbiosis)在其病因学方面起了重要作用，这一亚型的临床特征除表现ASD核心症状外，还有胃肠功能障碍，如慢性便秘、腹泻、便秘与腹泻交替出现、腹胀、腹痛等。Young AM等[4]依据血清免疫学方面的研究结果也提出部分ASD患者由于肠道炎症原因导致机体出现免疫功能失调与其发病有关，支持上述观点。一组针对1513例月龄为20～60个月之间的儿童的样本研究，结果发现ASD儿童出现胃肠功能障碍的几率是正常对照组的6～8倍之多，且胃肠症状与ASD的严重性呈正相关[6]。Mazurek MO等[7]调查了2 973例ASD儿童，结果发现24%的患儿经历至少一种类型的胃肠问题，并且胃肠问题密切联系患儿的感觉反应过度和焦虑症状，提示患儿的感觉反应敏感和焦虑多由慢性胃肠问题所致。迄今，报道ASD胃肠问题的发生率差异较大，为9%～91%，平均为47%[8]，原因与研究方法、诊断标准等不同有关。国内李素水等[9]研究报道ASD组胃肠功能失调的发生率为43.33%，高于精神发育迟滞组的21.66%和正常对照组13.33%，结论支持伴有胃肠功能失调的孤独症可能为ASD一亚型。进一步研究提示该亚型存在食物不耐受现象，多为消化谷蛋白和酪蛋白异常，禁食相关食物对ASD核心症状有效，尤其是在治疗的早期阶段[10]。

另一方面研究是探讨ASD患儿肠道微生物的成分改变。Wang L等[11]对54例儿童进行了研究，其中ASD患儿23例、ASD的健康同胞22例和正常对照组9例，结果发现与对照组相比，ASD儿童粪便标本中萨特菌(Sutterella spp.)数量增多，并且与不伴有功能性胃肠问题的ASD相比，伴有胃肠问题的ASD扭链瘤胃球菌(Ruminococcus Torques)明显增多。另一项研究选取ASD患儿33例，正常发育同胞7例和正常对照组儿童8例，结果发现ASD患儿的便标本中拟杆菌(Bacteroidetes)数量较多，正常对照组儿童中厚壁菌门(Firmicutes)数量较多，而同胞对照组的微生物种类和数量处于二者之间，提示遗传和环境因素共同作用决定了ASD患儿的肠道微生物成分[12]。Rose DR等[8]通过便标本对伴有胃肠症状的ASD患儿进行了微生物方面的研究，结果伴有胃肠症状ASD组与伴有胃肠症状正常发育儿童组之间微生物成分有差异，ASD组拟杆菌科、裂果螺科(Lachnospiraceae)、普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科显著增多；而无胃肠症状的ASD组和无胃肠症状的正常儿童组比较差异无统计学意义。因此，上述研究提示ASD患儿的肠道微生物成分发生了改变。也有研究报道了不一致的结论，分析可能与研究方法、ASD的异质性、高级抗生素使用和饮食结构有关[2]。

分析ASD患儿伴有较多胃肠功能失调症状的原因，可能与微生物-肠-脑轴功能失调有关[12]。首先，短链脂肪酸(Short-chain Fatty Acids, SCFAs)是微生物的代谢产物，也是微生物-肠-脑轴中的重要介质，能穿过血脑屏障，直接调节脑活性。MacFabe DF[13]报道ASD患儿便标本中总SCFAs水平下降，包括乙酸(Acetic Acid,AA)、丙二酸和丙酸(Propionic Acid,PPA)。Foley KA等[14]通过鼠模型研究发现，孕期暴露PPA明显地损害后代新生儿和少年期的社交行为，表明母亲的肠道微生物成分可能影响后代患ASD风险。成年老鼠脑室内和外周给予PPA后产生各种行为缺陷，与ASD患者中观察到的行为特点很相似。大量的PPA迅速进入血液后，穿过血脑屏障(Blood-Brain Barrier,BBB)，在脑内神经元集聚，引起细胞内酸化，然后改变神经递质释放和神经元活性[12]。另外，研究还发现，给予啮齿类物种PPA和丁酸(Butyric Acid,BA)也导致基因表达改变，基因表达改变影响神经递质系统、神经细胞黏附分子、炎症、氧化应激、脂类代谢和线粒体功能，这对ASD均有重要意义[15，16]。其次，大部分ASD患者均有使用广谱抗生素的病史。口服抗生素后破坏肠道内的保护性微生物群，并引起厌氧菌增殖，例如梭菌属(Clostridia)、拟杆菌和脱硫弧菌(Desulfovibrio)三种厌氧细菌是引起ASD患儿胃肠症状和孤独症行为的常见细菌[13]。另外，这些细菌也产生一些代谢产物调节小肠免疫系统与ASD的病理学机制有关，如梭菌属破伤风梭菌(Tetani)是一种随处可见的厌氧杆菌，产生一种强效的神经毒素即破伤风神经毒素(Tetanus Neurotoxin, TeNT)，迷走神经具有传输TeNT的能力，将其从肠道传输到大脑，然后TeNT通过分解突触生长蛋白破坏神经递质的释放，导致各种孤独症样行为缺陷。3-羟基苯基-3羟基丙酸是一种特殊的梭菌类代谢产物，它具有耗竭脑内儿茶酚胺效应，产生ASD症状，支持梭菌属和ASD病因学之间具有相关性[12]。脱硫细菌是另一种革兰氏阴性厌氧杆菌，与梭菌不同，不产生孢子，脱硫细菌导致大量硫代谢异常产生毒性物质可能关系ASD的病理生理学[12]。细胞杂志发表的重要研究成果，ASD鼠模型研究发现肠道微生物的异常对行为产生影响，成年雌性鼠免疫活化出生的后代具有ASD特征、肠道微生态失调(梭菌属和拟杆菌发生改变)和血清代谢物改变。还发现应用代谢物4-乙基苯基硫酸盐(能增加免疫活化)治疗幼小鼠(Naive Mice)产生ASD相关行为异常，提示肠道微生物作用于宿主产生的代谢产物影响生物行为[17]。因此，ASD鼠模型研究结果支持微生物-肠-脑之间的相互联系。

因此，生命早期肠道微生物-肠-脑轴功能失调可能是部分ASD的神经生物学基础，该亚型除ASD核心症状外，还伴有便秘、腹泻、腹胀等胃肠功能特征，修复肠道微生物菌群可能对治疗ASD有重要意义。

2 益生菌可能的理论机制

Critchfield JW等[18]通过综述文献首次提出益生菌对ASD有益，并指出相关机制和证据：(1)ASD患者出现胃肠症状有腹胀、肠蠕动困难和腹痛等，与肠激惹综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)很相似，益生菌能成功治疗IBS患儿，提示益生菌也可能改善ASD的胃肠症状；(2)ASD儿童梭菌属类升高，高水平梭菌属患者易出现胃肠问题，应用靶向梭菌属药物治疗胃肠症状的同时也改善ASD患儿行为和交往异常，提示益生菌对ASD相关行为也有效；(3)ASD患者小肠渗透性增加，益生菌有改善小肠渗透性的作用，其机制是减少细菌过度生长稳定黏膜屏障，合成抗氧化物，增加黏蛋白表达，刺激黏膜免疫力，短期暴露益生菌增强人体上皮紧密连接蛋白；(4)许多结果支持部分ASD患儿存在异常免疫活化，大部分免疫系统集中在小肠黏膜周围，肠道微生物对免疫系统成熟和调节起了重要作用，益生菌产生的效应可能作用于免疫系统，以物种特异性方式调节免疫系统。目前，离体研究已发现益生菌株具有抗炎效果，但是与细胞因子以及其他肠道微生物之间的相互作用还有待进一步证实。

Hsiao EY等[17]通过母系免疫活化(Maternal Immune Activation,MIA)鼠模型对益生菌作用机制进行了开创性研究。MIA母亲出生的后代鼠病理学表现为肠道渗透性增加、小肠细胞因子水平异常以及由梭菌属和拟杆菌属导致的菌群失调，后代鼠表现为ASD样行为和相关神经病理学特征，这与伴有胃肠功能障碍的ASD患儿亚型很相似。应用脆弱拟杆菌(Bacteroides Fragilis)益生菌治疗能矫正MIA后代鼠的小肠渗透性增加，而且使结肠部位的促炎性细胞因子白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)水平增加复原，但其他细胞因子无变化，提示IL-6对ASD样行为具有特异性。再者，与对照组的后代鼠相比，MIA后代鼠在67个菌种中6个丰富菌种有显著性差异，而且益生菌能恢复这种差异，提示脆弱拟杆益生菌能减轻MIA模型后代鼠的肠道菌群失调，并改善后代鼠的异常交往、重复、感觉运动和焦虑样行为，但对社会交往和社会性缺陷无效，该作者认为社会性行为可能受其他路径调节。另外，还发现多形拟杆菌(Bacteroides Thetaiotaomicron)益生菌也有脆弱拟杆菌相似的效应，但粪肠球菌益生菌无相应治疗作用。因此，研究表明益生菌可能减轻炎症、改善肠道渗透性和恢复微生物平衡，减轻ASD非社会性缺陷症状，值得广泛应用，并进一步探讨相关机制。

3 益生菌和神经发育之间的潜在关系

依据ASD肠道微生物和炎症的理论假说，做如下推断：(1)Hsiao EY等[17]发现益生菌脆弱拟杆菌改善结肠部位促炎性细胞因子IL-6水平。全身性炎症影响大脑的机制之一是外周肿瘤坏死因子-α调节脑部小胶质细胞应答。因此，如果ASD儿童的母亲在胎儿发育关键阶段经历了感染，全身性炎症就有可能影响到胎儿神经元发育，此时若给予影响促炎性细胞因子的脆弱拟杆菌等益生菌，就可能预防脑部炎症。如果MIA模型是部分ASD的病理学机制就能预防ASD样症状出现。相似研究中，Young AM等[4]提示母亲MIA能导致胎盘和羊水促炎性细胞因子水平增加，抗炎细胞因子水平下降，如果在母亲感染期间阻断促炎性细胞因子，那么也能预防后代ASD样行为。因此，建议在孕期或新生儿早期使用矫正异常免疫应答的特殊益生菌来预防ASD风险。近来动物老鼠[19]研究结果支持益生菌具有纠正代谢紊乱，减少多器官炎症的效应。(2)肠道微生物对神经发育有重要作用，包括从神经发生到髓鞘形成，从突触剪修到神经递质，以及受体产生。如果与Hsiao EY等[17]研究结果相一致，那么益生菌就能恢复ASD个体在母孕期间由于遗传原因和各种未知原因所导致的肠道菌群失调，然后预防肠道微生物改变所致的神经发育有害效应。(3)Hsiao EY等[17]发现MIA导致肠道某些相关紧密连接蛋白的表达改变，应用脆弱拟杆菌益生菌治疗能改善这种变化。由于Fiorentino M等[20]研究发现ASD个体有两方面基因表达改变，即与BBB功能和完整性相关的基因表达改变，以及肠道紧密连接蛋白表达改变，导致屏障的毛孔形成增加，屏障功能下降，结果支持肠道微生物在BBB形成和维护方面起了重要作用，推测益生菌有可能对BBB的紧密连接蛋白也有相似效应。因此，如果益生菌能增加BBB紧密蛋白的表达，加强BBB的致密性，将使导致ASD易感基因的环境毒物控制于脑外，抑制相关易感基因的产生就能成功预防ASD神经元的发生。

Pärtty A等[21]研究结论支持上述推论，将出生6个月的婴儿随机分为益生菌组和安慰剂组，结果益生菌组无一例发生ASD或注意缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)，而安慰剂组有17%被诊断，结论支持新生儿早期应用益生菌能减少ASD风险。Shaaban SY等[22]应用三联益生菌(嗜乳酸杆菌、鼠李糖乳杆菌和长双歧杆菌)对埃及30例5～9岁伴有胃肠症状的ASD患儿进行了为期3个月的开放性前瞻性研究，发现益生菌能减少胃肠症状，并减轻ASD症状的严重性，该作者认为益生菌应作为ASD儿童重要的辅助治疗方法，值得广泛应用。由于益生菌不是单一微生物成分，儿童肠道微生物成分也是有差异的，通过观察有无神经精神障碍的儿童发现，益生菌产生的中枢神经系统效应不是改变肠道微生物组成成分，而是通过增加益生菌数量，减少炎症、强化屏障、矫正肠道微生物活性不平衡、纠正过多的有害代谢产物所致。

关于益生菌是否影响相关基因表达还无肯定结论。动物实验得出初步结论，牛实验研究系统性地给予益生菌后发现，影响整体基因表达包括机体免疫力和体内稳态基因[23]。小鸡研究发现益生菌导致小肠黏蛋白基因高表达[2]。把人体细菌移植给鼠，益生菌能改变肠道微生物编码酶的表达，该酶与碳水化合物代谢路径有关，提示未来研究方向应集中于益生菌在基因表达方面的影响[2]。目前，人类证据仅提示益生菌提高小肠基因表达效应，加强肠道屏障的完整性，应进一步研究益生菌能否影响脑基因表达，继而影响ASD的神经病理学。

4 粪便微生物移植益生菌在ASD患者中的应用

鉴于ASD肠道微生物异常和胃肠症状之间的关系，以及粪便微生物群移植(Fecal Microbiota Transplantation,FMT)治疗艰难梭菌属感染的有效性，因此将健康个体的粪便微生物移植到肠道菌群失调的机体中，已建议用于ASD患儿[24]。通过改良FMT程序-微生物群移植疗法，包括起初的抗生素治疗、肠清洁和延长粪便微生物移植，结果发现18例ASD患儿中有80%的患儿胃肠症状减少，并明显改善ASD症状[25]。不过，也有报道ASD儿童若肠道内脱硫弧菌大量增加者，给予该方法将恶化ASD症状，也可能加重胃肠症状，提示实施FMT是有条件的，否则将对患儿有害。进一步说，FMT也存在不良反应，有一项研究报道供体粪便侵入后，94%患儿有腹泻，31%出现痉挛，19%打嗝，19%便秘，降低了FMT对ASD个体的使用[26]。Navarro F等[5]提出FMT对ASD患儿胃肠症状无效。因此，目前对FMT的最新评价是仅限于研究，不支持临床应用。

5 小结

在未来的研究中，首先应依据动物模型进一步探讨益生菌的生物学机制；其次，尽管已知益生菌有特异性菌株效应，但是应依据分子微生物学、免疫学、神经学技术探讨不同种类益生菌作用于宿主能改变行为的确切机制，即不同菌株益生菌改善行为的相关神经路径。另外，应进一步多中心开展益生菌的研究，探讨对伴有胃肠症状ASD亚型的临床疗效。

目前，动物实验和人类研究初步认为益生菌治疗ASD患儿有效，尤其是伴有胃肠功能障碍的患者，既能改善胃肠症状，又能减少ASD相关行为异常。孕期应用益生菌还可能降低后代患ASD的风险。益生菌的作用机制是通过增加肠道益生菌的数量，减少炎症、强化屏障、矫正肠道微生物活性不平衡、纠正过多的有害代谢产物。未来研究方向应进一步完善ASD的临床分型、确定胃肠功能障碍的统一诊断标准以及益生菌改善行为的相关神经生物学基础，即微生物群-肠-脑轴之间相互联系的病理生理学机制。